Тy-элементы (transposon yeast) – целое семейство МГЭ дрожжей, подобных сложным транспозонам бактерий по типу транспозона Tn3, длина – 6,3 тис. п.н., окружены длинными концевыми прямыми повторами, количество на геном 30-35 копий, могут давать эффект «мутационного взрыва»;

Copia-подобные элементы дрозофил, длина около 5 тис. п.н., имеют идентичные прямые повторы (276 п.н.), иногда существуют в виде кольцевых молекул ДНК, что отличает их от бактериальных транспозонов, которые не существуют за пределами генома. Их длинные повторы, очевидно, выполняют функции промоторов.

Трансформацией в генетике называют перенос генов из одного организма в другой. Это явление было открыто в 1928 году Ф. Гриффитсом при изучении бактерий. Исследование молекулярных механизмов трансформации привело О.Т. Эйвери, К.М. Маклеода и М. Маккарти в 1944 году к важнейшему выводу о том, что носителем информации о наследственности в клетке является именно ДНК, а не белок, как полагали до этого. ДНК, передаваемая в бактериальную клетку, в природе получается в результате гибели и разложения других клеток, в то время как в эксперименте объектом переноса становится специально выделенная и приготовленная ДНК.

У эукариот трансформация в природе до сих пор не обнаружена. Что же касается экспериментальной передачи ДНК из одной клетки в другую, то на протяжении многих лет опыты не приводили к положительным результатам. В конце 1970-х - начале 1980-х годов многие исследовательские группы азартно конкурировали друг с другом, пытаясь первыми осуществить перенос ДНК. Успехи были весьма редкими: молекулы ДНК, инъецированные микрохирургически в ранние эмбрионы некоторых видов млекопитающих, амфибий, морских ежей, иногда встраивались в хромосомы клетки-хозяина. У дрозофилы искусственно введенная ДНК почти не включалась в хромосомы эмбриона, хотя в культуре клеток типичная трансформация происходит довольно часто. Однако очевидно, что из такой клетки невозможно получить организм и трансформированная ДНК не может передаваться потомству.

В конце концов в 1982 году повезло двум американским исследователям Дж. Рубину и А. Спрадлингу. Для осуществления переноса ДНК они использовали в качестве транспортного средства (вектора) мобильный генетический элемент, так называемый Р-элемент. Мобильные элементы генома - это небольшие фрагменты ДНК длиной 1-7 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.), которые существуют в клеточном ядре, размножаясь вместе с хромосомами клетки хозяина. Они способны перемещаться по геному, то есть могут встроиться в ДНК одного района хромосомы, затем покинуть этот участок и встроиться в другой. Вся структура Р-элемента организована так, чтобы обеспечить его перемещения. Р-элемент имеет длину около 3 т.п.н. и фактически весь представлен одним геном, состоящим из четырех экзонов. Этот ген кодирует транскрипт размером 2,7 т.п.н., с которого транслируется белок с молекулярным весом 87 кДа. Этот белок называется транспозазой, он обеспечивает перемещения (транспозиции) Р-элемента в пределах ДНК генома клетки хозяина. Для осуществления транспозиции у Р-элемента существуют специально устроенные структуры - концевые повторы - по 150 п.н. определенной последовательности на каждом конце элемента, совершенно необходимые для перемещений. Именно с этими участками связывается транспозаза и катализирует процесс встраивания-вырезания Р-элемента. Таким образом, для нормального перемещения Р-элемента нужно, чтобы были выполнены два условия: 1) наличие у него неповрежденных концевых повторов и 2) нормальная активность транспозазы. Если будет нарушен какой-либо из экзонов гена транспозазы или во время транскрипции и созревания матричной РНК транспозазы не будет удален один из интронов, полноценного фермента транспозазы не получится и Р-элемент не будет перемещаться. Однако недостаток транспозазы из одного Р-элемента может быть легко компенсирован, если в геноме присутствует еще один Р-элемент (нормальный), который и обеспечит наличие транспозазы.

Учитывая все перечисленное выше, эксперимент по трансформации у дрозофилы схематически выглядит следующим образом: готовят ДНК двух Р-элементов, один из которых может синтезировать транспозазу, но неспособен встраиваться в геном, так как у него поврежден один из концевых (с 3'-конца) повторов - rp25,7wc , в то время как во втором Р-элементе удалена значительная часть гена транспозазы, но он может перемещаться по геному, поскольку имеет нормальные концевые повторы - это P[(ry+)A]

В Р-элемент P[(ry+)A], являющийся вектором и имеющий дефективный ген транспозазы, обычно встраивают дополнительный фрагмент ДНК длиной до 20 т.п.н., который хотят трансформировать в геном дрозофилы. Р-элемент P[(ry+)A] называют транспозоном, а rp25,7wc - элементом-хелпером, или помощником. Затем смесь этих двух сортов ДНК инъецируют в яйцо дрозофилы. Там некоторая ее часть встраивается в ДНК полярных клеток, из которых позднее образуются клетки зародышевого пути. Таким образом, чужеродная ДНК, инъецированная в эмбрион на ранних стадиях развития, передается следующим поколениям потомков.

Многие факторы, в том числе и размер встроенного в Р-элемент фрагмента чужеродной ДНК, влияют на успех трансформации. В среднем только около 14% инъецированных эмбрионов развиваются в плодовитое потомство. Поэтому возникает вопрос, как различить мух, у которых инъецированная ДНК встроилась в геном, и мух без встройки. В Р-элемент P[(ry+)A] вводят специальные маркерные гены. Это могут быть либо гены дрозофилы, контролирующие окраску глаз, например ген rosy, гены дрозофилы, кодирующие синтез ферментов, например алкогольдегидрогеназы, или даже ген, выделенный из генома медузы, кодирующий белок, обнаруживающий при определенных условиях зеленую флуоресценцию.

Разберем схему, в которой используется ген rosy . В этом случае в Р-элемент P[(ry+)A] введен фрагмент ДНК, содержащий нормальный аллель гена rosy . ДНК транспозона вместе с ДНК хелпера инъецируют в эмбрионы, гомозиготные по мутации ry506 гена rosy. Если транспозон P[(ry+)A] встроился в геном, то в поколении G1 появятся мухи с нормальным цветом глаз, поскольку у них - гомозигот по мутации ry506 - появится ДНК с нормальным аллелем гена ry+ в транспозоне.

С какими целями используют трансформацию в экспериментальной генетике? Можно выделить несколько направлений.

1. В процессе клонирования и выделения генов всегда остается вопрос, весь ли ген уже в руках экспериментатора, то есть полностью выделены ли его регуляторная и структурная части. Для выяснения вопроса в состав транспозона вводят фрагмент ДНК, предположительно содержащий ген, это фрагмент А в транспозоне P[(ry+)A] на рис. 2. Затем хромосому со встроенным транспозоном P[(ry+)A] путем скрещивания вводят мухам, гомозиготным по мутации испытуемого гена. Если в транспозоне присутствуют все части гена А, необходимые для его функционирования, то такая особь будет иметь нормальный фенотип, поскольку мутантное действие гена А полностью перекрывается нормальным аллелем А+, расположенным в транспозоне.

Нетрудно заметить, что, хотя эти работы и выполнены на дрозофиле, по сути речь идет об исправлении генетических дефектов посредством вмешательства человека. Если учесть, что трансформация у дрозофилы за последние 16 лет применялась тысячи раз, становится очевидным, что по крайней мере на этом модельном объекте проблема исправления генетических дефектов уже в наше время эффективно решается достаточно рутинными методами.

3. Трансформацию на дрозофиле используют для экспериментальной экспрессии генов, выделенных из других организмов, у которых еще не выделены мобильные элементы, пригодные для создания транспозонов, и разработки метода трансформации. Например, можно выделить какой-то ген из генома бабочки-шелкопряда или комара, ввести в геном дрозофилы и проанализировать экспрессию.

Созданы еще более уникальные конструкции, связанные с пересадками генов. Известно, что в геноме комара Chironomus thummi thummi присутствуют фракции, повторенные множество раз. Единицей этого повтора является фрагмент длиной 120 п.н., обогащенный А-Т нуклеотидами. Это так называемый Cla-повтор. Он рассеян по всей длине хромосом Ch. th. thummi, но почти полностью отсутствует у очень близкого вида Ch. th. piger, то есть этот повтор является варьирующей фракцией генома. Считается, что повторенные последовательности оказывают инактивирующее влияние на гены, расположенные рядом.

Для того чтобы проверить предположение об инактивирующем влиянии Cla-повтора, был создан транспозон, содержащий кроме маркерного гена rosy+ еще последовательность нуклеотидов, состоящую из нескольких копий повтора Cla из ДНК хирономуса и расположенного рядом с ним гена white (w), выделенного из генома дрозофилы. Этот транспозон был введен в эмбрионы дрозофилы, мутантные по гену w. Дело в том, что нормальный аллель гена w+ обеспечивает формирование красного цвета глаз у мухи, в то время как у гомозигот по мутации w глаза белого цвета. Если Cla-повтор не оказывает инактивирующего влияния на ген w+ в транспозоне, глаза у мух w / w / Tw+ будут нормального красного цвета. Если же Cla-повтор инактивирует ген w+ в транспозоне во всех клетках или только в некоторых, то глаза у мух будут соответственно полностью белыми или мозаичными, то есть в некоторых клетках ген w+ сохраняет активность, в других клетках w+ инактивирован.