(Ответ вариант-1)

Фаг М13 – один из наиболее просто устроенных фагов, состоящий из одноцепочечной молекулы ДНК размером – 7000 н., окруженный белковой оболочкой из 2700 субъединиц, которые упакованы по спирали. Оболочка вируса называется капсид. Нуклеиновая кислота и капсид вместе составляют нуклеокапсид. ДНК М13 содержит несущественную часть, которую можно заменить нужным фрагментом ДНК; инфекционность рекомбинантных вирусных частиц сохраняется. Наличие в фаговом геноме области, несущественной для его жизнедеятельности, является важным условием использования этого фага для конструирования гибридных молекул ДНК. У нитевидных фагов существует лишь межгенная область размером 500 нуклеотидов, в который могут быть произведены изменения (делеции, вставки) без нарушения жизнеспособности фага.

Репликативная форма фаговой ДНК не имеет участков распознавания многих рестртктаз, образующих при гидролизе липкие концы, а кроме того,  фаговый геном не содержит генетических маркеров, которые позволили бы легко выявлять гибридные фаги. Поэтому конструирование векторных нитевидных фагов включает в себя прежде всего введение в геном селективных маркеров уникальных участков расщепления определенными рестриктазами.

М13 – система имеет следующие преимущества: выделенная двухцепочечная репликативная форма может функционировать как плазмида, а одноцепочечная фаговая ДНК –используется в качестве матрицы для секвенирования ДНК. Все это позволяет использовать фаг М13 как комбинированную систему для клонирования и секвенирования ДНК.

(Ответ вариант-2)

Еще одна категория фаговых векторов для E.coli базируется на геномефага М13. Этот нитчатый «мужской» фаг (адсорбируется на F-пилях) содержит одноцепочечную ДНК. Когда фаговая ДНК проникает в клетки кишечной палочки, она реплицируется с образованием двухцепочечных («+»/«-») промежуточных продуктов, «+»-цепи которых затем вновь упаковываются с образованием множества фаговых частиц. Двухцепочечный промежуточный продукт (репликативная форма, РФ) накапливается в клетках в числе 100—200 копий. Его выделяют и используют как вектор для клонирования. Особенностью фага М13 является то, что он не убивает клетки, а лишь замедляет их деление. Частицы фага непрерывно выделяются в культуральную жидкость, и их титр может достигать 1012 в мл. При этом на газоне чувствительных бактерий фаг выявляется в виде мутных бляшек.

В состав ДНК фага для удобства введения чужеродной ДНК включают полилинкеры. Когда в РФ ДНК М13 встраивается гетерологичная последовательность, в фаговые частицы упаковывается только одна из цепей этой вставки (рис. 20.6).Одноцепочечные молекулы ДНК не применяют для конструирования векторов, поскольку их нельзя разрезать с помощью обычно используемых рестриктаз. Клонируя фрагмент в М13 в обеих ориентациях, можно получить большие количества каждой из цепей.

Для удобства отбора рекомбинантных форм (фагов, в геном которых произошла вставка чужеродной ДНК) используют вставки в некодирующую область вектора части lac-оперона E.coli, которая обусловливает комплементацию мутантной b-галактозидазы, и полилинкер. Когда в полилинкере отсутствует вставка, фаговые частицы на специальном мутантном штамме кишечной палочки в присутствии индуктора и хромогенного субстрата образуют голубые негативные колонии. Встраивание фрагмента ДНК в вектор в области полилинкера нарушает комплементацию, и бляшки остаются неокрашенными.

Преимуществом фаговых векторов на основе М13 является способность включать очень большие вставки, поскольку в данном случае процесс упаковки ДНК не зависит от размера фагового генома. Самое важное применение векторов-производных фага М13 состоит в получении одноцепочечных ДНК-матриц для секвенирования методом Сэнгера. Кроме того, однонитевые ДНК являются идеальной мишенью для сайт-специфического мутагенеза.

(Ответ вариант-3)

Фаговые векторы:

 Рисунок 8. Фаговые векторы. Слева — λ-Вектор замещения. Левое плечо (L) фаговой ДНК отвечает за синтез головки и отростка, правое (R) — за литический цикл, центральная область — за лизогенный (в составе хромосомы). Последнюю можно безболезненно заменить интересующей ДНК определенного размера и даже без селективных маркеров, так как только векторы со вставкой смогут образовать инфекционные частицы. Многие λ-векторы можно купить уже в виде двух плеч. Справа — M13mp18, одноцепочечный вектор на основе фага M13 (можно купить и двухцепочечный — M13mp18 RF). Зеленым обозначена ДНК фага, черным — полилинкер для клонирования, внедренный в lacZα (розовый), остальные элементы обеспечивают детекцию рекомбинантных ДНК с помощью lacZ (сине-белого теста).

Векторы на основе фага М13.

Этот фаг совсем не похож на λ (рис. 8) и на образ фага вообще — он нитчатый, его ДНК кольцевая и одноцепочечная. Векторы на его основе не участвуют в ёмкостной гонке, а служат для других целей. Распознав подходящего хозяина по половым пилям на клетке, М13 «раздевается», и по матрице его ДНК синтезируется копия — формируется двухцепочечная, репликативная форма (RF) фага. Но в состав вириона потом войдет лишь одноцепочечная ДНК, причем в отношении ее размера М13 не капризен. Другой вопрос, что ему нужно абсолютно всё, что он кодирует, поэтому только небольшие вставки не нарушат репликацию этого фага. М13-векторы содержат типичные для плазмид системы селекции — например, lacZα со всем необходимым. От лямбды М13 отличается деликатностью в отношении хозяина: фаг немного замедляет его развитие, но «одевается» тихонько и уходит по-английски. Одноцепочечную рекомбинантную ДНК выделяют из фагов, которых находят в слабо выраженных бляшках на газоне E. coli, а двухцепочечную — как обычную плазмиду из расположенных там же клеток.

Одноцепочечные векторы удобны для приготовления меченых зондов, олигонуклеотид-направляемого мутагенеза и секвенирования дидезоксиметодом. Последняя цель уходит в историю, потому что и секвенировать сейчас стараются иначе, и приспособленных для этого плазмид уже немало. Сайт-специфический мутагенез с помощью олигонуклеотидов, напротив, набирает обороты: его быстрота и прецизионность немыслимы для классического, случайного мутагенеза. Он активно применяется в фундаментальных исследованиях, производстве ГМО и белковой инженерии. Другой вопрос, что олигонуклеотид-направляемый мутагенез сейчас реже опирается на М13-векторы и чаще сочетается с ПЦР и техниками редактирования генома in vivo.

(Ответ вариант-4)

Зайдите через браузер хром и переведите страницу, здесь очень хорошо показана структура данного фага и вообще все про него, включая +/– цепи и применение !!! http://www.wwnorton.com/college/biology/microbiology2/ch/11/etopics.aspx