Можешь отсюда читать ---- https://biomolecula.ru/articles/metody-v-kartinkakh-sekvenirovanie-nukleinovykh-kislot , но там очень много рекламы секвенаторов и все написано в разбросе!

ИЛИ ЧИТАЙ ДАЛЬШЕ! и не нужно умирать! Этот файл отправил Искаков Б.К.

34 Использование радиоактивных зондов для обнаружения клонированных генов. Основные методы получения радиоактивных нуклеиновых кислот (ник-трансляция, мечение 5’- и/или 3’-концов). Скрининг библиотек генов с помощью олигонуклеотидных зондов.

До разработки ПЦР, методами обнаружения и выделения специфических фрагментов ДНК были гибридизация с ДНК-зондами и клонирование. ДНК-зонд — одноцепочечная ДНК, длиной до 30 нуклеотидов, используемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера или среди множества разнообразных молекул ДНК.

ДНК-зонды можно синтезировать искусственно либо выделить из генома. Затем эти послед-ти клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном кол-ве. В любой клонированный фрагмент можно ввести метку (радиоактивный изотоп и др.) и использовать его как специфический молекулярный зонд.

Радиоактивные зонды выявляют с помощью радиоавтографии. Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. После удаления не связавшихся молекул ДНК и специфической обработки, в зависимости от типа использованного зонда, места хромосомной локализации последовательностей ДНК, комплементарных соответствующим ДНК-зондам, наблюдают в микроскоп в виде характерных светящихся точек.

Ник-трансляция. Этот метод применяется для выявления ДНК, поскольку соответствующие зонды легко получать и с ними удобно работать. Метод включает внесение в двухцепочечную ДНК случайных разрывов, в результате чего образуются меченые фрагменты разной длины с разным соотношением между векторной ДНК и вставкой. Такие фрагменты при отжиге соединяются друг с другом по перекрывающимся послед-тям, образуя сеть, что приводит к усилению сигнала в месте локализации послед-ти-мишени и повышению чувствительности метода.

Мечение 3'-концов двуцепочечного фрагмента ДНК проводят с помощью фрагмента ДНК-полимеразы I E. coli или ДНК-полимеразы фага Т4 и соответствующего меченного по α-положению дНТФ (Дезоксирибонуклеозидтрифосфат). Мечение З'-концов как одно-, так и двуцепочечного фрагмента ДНК осуществляют с использованием терминальной трансферазы и меченного по α -положению подходящего нуклеотидного предшественника. В случае с фрагментом ДНК-полимеразы I для эффективного мечения необходимо наличие фрагментов ДНК с выступающими 5'-концами, образованными при расщеплении ДНК определенными рестрикционными эндонуклеазами. Для этого необходимо добавление в реакционную смесь конкретного дНТФ, комплементарного первому нуклеотиду в выступающем участке молекулы. Т.к. фрагмент ДНК-полимеразы I имеет низкую 3' → 5'-экзонуклеазную активность, то возможное мечение тупых и 3'-выступающих концов не принимают во внимание. Но добавление в реакционную смесь всех четырех дНТФ (один из которых меченый) позволяет полностью исключить эту вероятность, кроме случаев, когда для обоих концов будут требоваться одинаковые меченые дНТФ. Более высокая эффективность мечения может быть достигнута, если в результате расщепления фрагмента ДНК какой-либо рестрикционной эндонуклеазой образуются 5'-выступающие концы с одинаковыми нуклеотидами. Например, рестрикционная эндонуклеаза ЕсоRI генерирует выступающие концы со следующей последовательностью: 5'-ААТТ-3'. Таким образом, в результате мечения могут образоваться более высоко меченные фрагменты ДНК с двумя нуклеотидами, несущими метку.

Библиотека генов - это полный набор клонированных перекрывающихся ДНК-фрагментов. Скриниринг библиотеки генов, осуществляют для поиска нужных последовательностей ДНК. Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК- или любыми иными ДНК-зондами.

Скрининг включает несколько последовательньгх этапов:

1. высевание химерных фагов библиотеки на газон бактерий, растущих на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри (каждая литическая бляшка на бактериальном газоне - результат инфицирования клеток одним клоном фага);

2. «перепечатывание» полученных культур на другие чашки Петри с целью их дублирования;

3. перенос растущих и лизированных исходных колоний на фильтр с одновременным разрушением клеточных мембран, фиксированием белков и ДНК;

4. блот-гибридизация с меченым олигонуклеотидным зондом.

5. Заключительный этап скрининга включает выявление положительных колоний фагов методом радиоавтографии и их отбор на дублированных культурах. С целью избежания ошибок проводят неоднократный скрининг отобранных колоний.