В качестве носителей используют бумагу, гели крахмала, агара, полиуретанов, ацетат-целлюлозной мембране и др.

Чаще используют электрофорез на бумаге как наиболее простой по технике выполнения. Проводится следующим образом: на полоску специального сорта бумаги, пропитанной соответствующим буферным раствором, наносят капельку сыворотки крови. Концы полоски опускают в чашечки, заполненные данным буферным раствором и снабженные электродами. При пропускания постоянного электрического тока отдельные белки сыворотки перемещаются вдоль полоски с разными скоростями, а иногда и в разных направлениях. По истечении определенного времени пропускание тока прекращают, полоску бумаги подсушивают и обрабатывают реактивом на белок. При этом на бумажной электрофореграмме выявляются окрашенные пятна. По числу пятен судят о количестве белковых фракций, а по интенсивности окраски пятен — о количественном содержании каждой белковой фракции в исследуемой сыворотке.

Существует множество разновидностей и модификаций методов электрофореза, которые используются (или использовались в определённые периоды развития биохимии и молекулярной биологии) в различных областях^[3]:

· Электрофорез в свободных средах (без поддерживающей среды)

o Электрофорез с подвижной границей

o Зональный электрофорез без поддерживающей среды

· Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой

o Электрофроез белков в крахмальном геле^[4]

o Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)^[5]\

Разделение белков можно производить по изоэлектрической точке (pI), молекулярной массе, электрическому заряду или по сочетанию этих параметров.

Наиболее распространенный способ разделения белков — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (англ. SDS) по Лэммли.^[5] SDS вызывает денатурацию белков и поддерживает их в денатурированном состоянии, для разрушения вторичных и третичных структур белков используют восстановители дисульфидных связей, например, дитиотреитол и меркаптоэтанол. Денатурированные полипептиды мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду, при этом белки меньшего размера двигаются быстрее и, таким образом, разделяются в соответствии с молекулярной массой. Концентрация акриламида определяет разрешающую способность геля — чем выше концентрация акриламида, тем лучше разрешение низкомолекулярных белков. Низкая концентрация акриламида улучшает разрешающую способность для высокомолекулярных белков. Также возможно использование двумерного электрофореза (2-D). В таком случае разделение белков производят в двух направлениях — в соответствии с их изоэлектрической точкой в первом направлении и в соответствии с молекулярной массой — во втором.

Образцы на гель наносят в карманы. Как правило, одну из «дорожек» оставляют для маркеров молекулярной массы (смеси белков с известными массами). После подачи напряжения белки двигаются в электрическом поле с различной скоростью. Отличия в скорости продвижения — электрофоретической подвижности — приводит к разделению белков на полосы (англ. bands).

o  Электрофорез белков в агарозном геле

o Электрофорез на бумаге

o Электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране

o Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды

· Капиллярный электрофорез

·

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ, англ. IEF), или электрофокусирование — технология разделения молекул (чаще всего — белков) по разнице в их изоэлектрических точках. Это разновидность зонного электрофореза, которую обычно производят в геле. Белок, который находится в рН-зоне ниже собственной изоэлектрической точки, будет положительно заряжен и будет перемещаться к катоду. В результате перемещения заряд молекулы будет снижаться, а перемещение — замедляться. В результате белки образуют четкие полосы, и каждый белок будет располагаться в градиенте значений рН в соответствии со своей изоэлектрической точкой. Данная технология дает возможность очень чёткого разделения белков, отличающихся по изоэлектрической точке.

Изотахофорез (ИТФ) — метод разделения различных типов ионов по их подвижности в электрическом поле. При ИТФ все виды ионов мигрируют в одном направлении, образуя набор зон, находящихся в равновесном состоянии и перемещающимися с одинаковыми скоростями.

Вестерн-блоттинг — аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков.

Подготовка образца

Образец может быть взят из цельной ткани или из клеточной культуры. В большинстве случаев твёрдые ткани сначала измельчаются с использованием блендера (для образцов большого объёма), гомогенизатора (меньшие объемы) или обработки ультразвуком. При этом бактерии, вирусы и другие компоненты окружающей среды также являются источником белков.

Для улучшения лизиса клеток и растворения белков могут быть применены различные детергенты, соли и буферы. Для предотвращения расщепления образцов их собственными ферментами часто добавляют ингибиторы протеаз и фосфатаз. Подготовка тканей часто выполняется при низких температурах, чтобы избежать денатурации белка.

Для разделения различных клеточных компартментов и органелл применяют комбинации биохимических и механических методик фракционирования, в том числе различные типы фильтрации и центрифугирования.

Гель-электрофорез

(выше описан)

Перенос на мембрану

Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (англ. PVDF). Мембрана накладывается поверх геля, а поверх неё кладут стопку фильтровальной бумаги. Всю стопку помещают в буфер для переноса, который под действием капиллярных сил продвигается вверх по бумаге, унося с собой белки. Другой метод переноса белков называется электроблоттингом и использует электрический ток, который переносит белки из геля на мембрану. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. В результате этого «промакивания» (от. англ. blotting) процесса белки удерживаются на тонком поверхностном слое мембраны для детекции. Оба варианта мембран используют из-за их свойства неспецифично связывать белки. Связывание белков основано как на гидрофобных взаимодействиях, так и на электростатических взаимодействиях между мембраной и белком.

Блокирование

Как только выбрана мембрана за её способность связывать белки, выбраны антитела и целевой белок, должны быть приняты меры по исключению взаимодействия между мембраной и антителом, используемым для детекции целевого белка (ибо антитело само по себе белок). Блокирование неспецифичных связываний достигается помещением мембраны в разбавленный раствор белка — обычно бычий сывороточный альбумин или нежирное сухое молоко (оба недорогие), с небольшим процентом детергента типа Tween 20 или Triton X-100. Белок из разбавленного раствора прикрепляется к мембране во всех местах, где не прикрепился целевой белок. Поэтому при добавлении антител единственное свободное место на мембране, куда они могут прикрепиться, — это сайты связывания на специфичных целевых белках. Этот фоновый «шум» в окончательном продукте вестерн-блота приводит к чистым результатам и исключению ложно-положительных

Детекция

После блокирования разведенный раствор первичных антител (обычно между 0.5 и 5 мкг/мл) инкубируется с мембраной и слегка встряхивается. Обычно раствор состоит из буферного раствора соли с небольшим процентным содержанием детергента, иногда с сухим молоком или БСА. Раствор антител и мембрана могут быть вместе закрыты и инкубированы где угодно от 30 минут до оставления на ночь. Также они могут быть инкубированы при различных температурах, при повышенной температуре наблюдается лучшее связывание — и специфичное (целевого белка, «сигнал1») и неспецифичное («шум»).

После полоскания мембраны, служащего для удаления несвязавшихся первичных антител, мембрану выдерживают в других антителах, напрямую связывающихся с класс-специфическими участками первичных антител. Они известны как вторичные антитела и в соответствии с их целевыми свойствами, как правило называются по типу «anti-mouse», «anti-goat», и так далее. Вторичные антитела обычно связывают с биотином или с репортёрным ферментом, таким как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена. Это значит, что несколько вторичных антител могут связываться с одним первичным и усиливать сигнал.

Анализ

После отмывки несвязавшихся меток вестерн-блот готов к детекции зондов, связавшихся с целевым белком. На практике, не во всех вестернах обнаруживают белки лишь по одному бэнду на мембране. Приблизительный размер вычисляют, сравнивая окрашенные бэнды с маркерами молекулярной массы, добавленными при электрофорезе. Процесс повторят с структурными белками, такими как актин или тубулин, которые не меняют между экспериментами. Количество целевого белка зависит от количества контрольного структурного белка между группами. Этот прием обеспечивает коррекцию количества общего белка на мембране в случае ошибки или неполного переноса.