Под понятием "вектор" понимается молекула нуклеиновой кислоты, способная после введения в клетку к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов репликации и транскрипции.
Векторные молекулы должны обладать следующими свойствами:
1) способностью автономно реплицироваться в клетке-реципиенте, то есть быть самостоятельным репликоном;
2) содержать один или несколько маркерных генов, благодаря экспрессии которых у клетки-реципиента появляются новые признаки, позволяющие отличить трансформированные клетки от исходных;
3) содержать по одному или, самое большее, по два участка (сайта) для различных рестриктаз в разных районах (в том числе в составе маркерных генов), но не в области, ответственной за их репликацию.
Структурные особенности вектора, необходимые для успешной экспрессии вводимого гена:
1) кодирующая последовательность чужеродного гена непрерывна;
2) ген находится под контролем промотора, который узнается РНК-полимеразой E. coli; Промотор (promoter) – участок ДНК, который инициирует транскрипцию гена. Находится на смысловой цепи рядом с геном . Промотор организует сайт прикрепления РНК-полимеразы и специальных белков – факторов транскрипции.Направление цепи «по течению» (downstream) - от 5' к 3'-концу, «против течения» (upstream) - от 3' к 5’ концу.
3) мРНК, считываемая с гена, правильно транслируется белок-синтезирующим аппаратом E. coli.
В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить на две группы: 1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена; 2) специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов. Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтез белковых продуктов клонированных генов. Векторы для экспрессии содержат последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток. В качестве прокариотических векторов используются плазмиды, бактериофаги. Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках. Большинство плазмидных векторов получено на основе природных плазмид ColE1, pMB1 и p15A.
Бактериальные плазмиды делят на два класса. Одни плазмиды (например, хорошо изученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способны переходить из клетки в клетку, другие такой способностью не обладают. По ряду причин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генетического материала, подавляющее большинство бактериальных плазмидных векторов создано на базе плазмид второго класса. Многие природные плазмиды уже содержат гены, определяющие устойчивость клеток к антибиотикам (продукты этих генов - ферменты, модифицирующие или расщепляющие антибиотические вещества). Кроме того, в эти плазмиды при конструировании векторов вводятся дополнительные гены, определяющие устойчивость к другим антибиотикам. В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для E.coli сконструированы плазмидные векторы для ряда других грамотрицательных бактерий (в том числе таких промышленно важных, как Pseudomonas, Rhizobium и Azotobacter), грамположительных бактерий (Bacillus), низших грибов (дрожжи) и растений.
Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созданы на базе геномов бактериофагов l и М13 E.coli. ДНК этих фагов содержит протяженные области, которые можно делегировать или заменить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. При конструировании семейства векторов на базе ДНК l фага из нее сначала (путем делений коротких участков ДНК) были удалены многие сайты рестрикции из области, не существенной для репликации ДНК, и оставлены такие сайты в области, предназначенной для встраивания чужеродной ДНК. В эту же область часто встраивают маркерные гены, позволяющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора. Такие векторы широко используются для получения "библиотек генов". Размеры замещаемого фрагмента фаговой ДНК и соответственно встраиваемого участка чужеродной ДНК ограничены 15-17 тыс. нуклеотидных остатков, так как рекомбинантный фагоый геном, который на 10% больше или на 75% меньше генома дикого l фага, уже не может быть упакован в фаговые частицы.
Таких ограничений теоретически не существует для векторов, сконструированных на базе нитчатого бактериофага М13. Описаны случаи, когда в геном этого фага была встроена чужеродная ДНК длиной около 40 тыс. нуклеотидных остатков. Известно, однако, что фаг М13 становится нестабильным, когда длина чужеродной ДНК превышает 5 тыс. нуклеотидных остатков. Фактически же векторы, полученные из ДНК фага М13, используются главным образом для секвенирования и мутагенеза генов, и размеры встраиваемых в них фрагментов намного меньше.
Эти векторы конструируются из реплекативной (двутяжевой) формы ДНК фага М13, в которую встроены "полилинкерные" участки (пример такой конструкции показан на рис. 2). В фаговую частицу ДНК включается в виде однотяжевой молекулы. Таким образом, этот вектор позволяет получать клонированный ген или его фрагмент как в двутяжевой, так и в однотяжевой форме. Однотяжевые формы рекомбинантных ДНК широко используются в настоящее время при определении нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера и для олигодезоксинуклеотид-направленного мутагенеза генов.
Дата: 2019-05-28, просмотров: 359.