Заключительным этапом ДНК-анализа на основе ПЦР является детекция продуктов амплификации, которая в подавляющем большинстве случаев осуществляется электрофоретическим разделением ПЦР-смеси на окрашенном бромистом этидием агарозном или полиакриламидном гелях, что позволяет идентифицировать продукт ПЦР по длине. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм.

Принцип гель-электрофореза заключается в следующем. Исследуемый препарат вносят в лунку, расположенную у края геля – полужидкой среды с сетчатой пространственной структурой. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток, они перемещаются в электрическом поле. Молекулы одинакового размера и одинакового заряда движутся единым фронтом, образуя в геле невидимые полосы. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся. Постепенно исходный препарат, состоящий из разных макромолекул, разделяется на зоны, распределённые по пластине геля.

В зависимости от размера образующихся в результате ПЦР ампликонов используют гель с содержанием агарозы от 1,5% до 2,5%.  Агароза – это особо чистая фракция, получаемая из агара или непосредственно из агарообразующих морских водорослей. Для приготовления агарозного геля в СВЧ-печи расплавляют смесь агарозы (агароза заранее содержит бромистый этидий), буфера для электрофореза и воды. Охлажденную до 50-60ºС смесь заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле лунки для нанесения образца (фото 6). Гребенки устанавливают таким образом, чтобы между дном лунок и основанием геля оставался слой агарозы в 1 мм. После застывания гель помещают в камеру для горизонтального электрофореза (фото 7), заливают буфер для электрофореза и в лунки вносят продукты амплификации в количестве 7-10 мкл. Затем камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30-45 мин. при напряженности электрического поля 10-15 В/см..

После окончания электрофореза гель помещают в специальный прибор – трансиллюминатор, две модели которого представлены на фото 8-9. Высокочастотные трансиллюминаторы предназначены для просмотра гелей в видимом и ультрафиолетовом диапазонах. Особым образом обработанные УФ-фильтры и специальные рефлекторные мембраны внутри трансиллюминатора позволяют создать в области просмотрового экрана равномерное интенсивное излучение с заданной длиной волны (254 нм). Результаты электрофореза учитывают с помощью видеосистемы.

При учёте результатов в первую очередь оценивают контрольные пробы (К+ и К-). В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю амплификации, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса на определённом уровне, который указан в инструкции по применению тест-системы. В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие такой полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации - загрязнении используемых реагентов исследуемой ДНК или ампликоном.

Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам или ДНК положительного контроля амплификации. Исследуемые пробы оценивают по наличию в соответствующей дорожке полосы, которая располагается на том же уровне, что и полоса положительного контроля (фото 10).

М 1   2   3 4   5 6    7    8 9  10  11 12 К- К+ М

Фото 10. Электрофореграмма результатов ПЦР

         М – маркёр молекулярных масс

К– отрицательный контроль амплификации

К+ положительный контроль амплификации

1, 2, 4, 7, 8, 9, 10, 11–отрицательные пробы (в треке только полоса внутреннего контрольного образца – ВКО)

3, 5, 6, 12 – положительные пробы (в треке 2 полосы – на уровне К+ и ВКО)