Полимеразная цепная реакция - это циклический процесс, принцип которого сводится к следующему: молекулу ДНК подвергают температурному плавлению при температуре 95ºС (денатурация) для расплетения двойной цепи ДНК; затем при охлаждении до 55-65ºС праймеры комплементарно присоединяются к специфическому фрагменту одноцепочечной ДНК (отжиг праймеров) и при последующем повышении температуры до 72ºС начинается ферментативный процесс достройки (синтеза, элонгации) молекулы ДНК при участии фермента Taq-полимеразы. Эти три операции составляют один цикл ПЦР и приводят к удвоению количества ДНК в исследуемом образце.

Стандартный цикл ПЦР – денатурация, отжиг праймеров и синтез – воспроизводится многократно и количество ДНК-ампликонов растёт в геометрической прогрессии, причём любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза новых молекул в последующих циклах ПЦР.

ПЦР даёт возможность за несколько часов из одной молекулы ДНК получить 100 млрд. таких молекул. Эта реакция проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и программируемый термостат (амплификатор).

Во время денатурации под действием высокой температуры (95ºС) происходит разрыв водородных связей между азотистыми основаниями двухцепочечной молекулы ДНК, цепи разделяются, и ДНК переходит в одноцепочечную форму. Обычно для денатурации достаточно 15-30 сек. Затем температуру понижают до оптимальной (для каждого возбудителя) температуры отжига праймеров (56-62ºС). Одноцепочечные участки ДНК, комплементарные друг другу, стремятся гибридизироваться, вновь образуя двухцепочечную структуру (в результате восстановления водородных связей между азотистыми основаниями). Однако благодаря тому, что в реакционной смеси концентрация праймеров гораздо выше, чем матричной ДНК, то преимущественно начинают образовываться комплексы «праймер –матричная ДНК», причём этот комплекс ограничен 5'-концами праймеров на обеих цепях исходной молекулы ДНК. При образовании такого комплекса появляются условия для начала работы Taq-полимеразы (двуцепочечная ДНК с выступающим 3'-концом является субстратом для ДНК-полимеразы). Время отжига праймеров различно и может составлять от 10 сек. до 1 мин. В дальнейшем температуру повышают до 72ºС (оптимальная температура работы фермента Taq-полимеразы), и начинается элонгация двухцепочечных молекул ДНК (рис. 4).

Матричная ДНК I.    Денатурация – 95ºС (расхождение цепей ДНК)     II. Отжиг праймеров (56-62ºС) на комплементарных участках матричной ДНК и образование комплекса «праймер–матричная ДНК»   III. Синтез (элонгация) цепей ДНК (72ºС) (из одной матричной молекулы ДНК после первого цикла ПЦР образуются две дочерние, которые в следующем цикле будут являться матрицами)

Рис. 4. Схема первого цикла полимеразной цепной реакции (Andy Vierstraete, 2001)

Процесс ПЦР также называют амплификацией (умножением), поскольку происходит копирование последовательности-мишени, копии которой в свою очередь копируются снова и снова, в результате чего получаются миллионы копий. Обычно проводят 35-40 циклов ПЦР. Проведение большего количества циклов может привести к снижению специфичности реакции.

Накопление продуктов амплификации носит экспоненциальный характер, схема представлена на рис. 5.

Рис. 5. Экспоненциальный характер течения ПЦР (Andy Vierstraete, 2001)

Постановку ПЦР осуществляют в специальном программируемом термостате – амплификаторе. На ветеринарном лабораторном рынке представлено достаточно много моделей амплификаторов как российского, так и импортного производства, наиболее распространённые в ветеринарных лабораториях России модели представлены на фотографиях 1-3. Есть различные критерии, которые учитывают при выборе амплификатора: тип нагревающего устройства, наличие или отсутствие нагреваемой крышки, количество лунок (формат), скорость термоциклирования, температурная однородность, удобство программного обеспечения и др.