ПЦР позволяет найти в исследуемом биологическом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного числа нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро размножить его. Фактически метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю.

Таким образом, метод ПЦР основан на уникальной способности ДНК к самовоспроизведению – репликации, включающей расплетение двойной спирали ДНК, расхождение ее нитей и достраивание на них дочерних цепей ДНК по принципу комплементарности. Кроме того, важным свойством ДНК является то, что 3',5'– фосфодиэфирная связь углеводно-фосфатного остова  молекулы наиболее чувствительна как к химическому, так и к ферментативному расщеплению.

Согласно принципу комплементарности, каждая цепь ДНК может служить матрицей для образования новой комплементарной цепи. Следовательно, после одного раунда репликации образуются две дочерние молекулы, каждая из которых имеет такую же нуклеотидную последовательность, как исходная молекула ДНК.

В живой клетке этот процесс происходит следующим образом: с помощью специальных ферментов происходит расплетение спирали в том ее участке, где должна происходить репликация. Водородные связи, связывающие нити, разрываются, и нити расходятся. Одна из цепей («+» или смысловая) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении – от 5'-конца к 3'-концу. Этот процесс осуществляется по принципу комплементарности ферментом ДНК-полимеразой. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока – небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, называемого праймером, с комплементарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. Репликация одновременно идет и на второй нити ДНК («-» или антисмысловой), только наращивание цепи происходит в обратном направлении, для репликации второй цепи также требуется свой праймер. В результате процесса репликации из одной ДНК образуются две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная.

Суть метода ПЦР заключается в том, что, маркировав такими блоками специфический участок ДНК, можно добиться синтеза дочерних цепей только в этом конкретном участке, а не по всей длине нитей ДНК. В результате происходит увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2ⁿ, где n – число циклов амплификации. Такая высокая степень направленного обогащения позволяет в значительной степени улучшить чувствительность анализа, что дает возможность проводить индикацию единичных клеток в исследуемой пробе.

Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки – праймеры размером 20-30 нуклеотидов, комплементарные участкам матричной ДНК, между которыми находится последовательность-мишень. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез протекает только между ними, обеспечивая удвоение искомого фрагмента. Праймеры входят в состав синтезирующейся последовательности – ампликона, размер которого определяется числом нуклеотидных пар между 5'-концами праймеров и составляет, как правило, несколько сотен нуклеотидных пар (в среднем от 200 до 1000 н.п.). Последовательность праймеров подбирается таким образом, чтобы она была статистически уникальна и не встречалась в двух участках ДНК, присутствующих в реакционной смеси.

ДНК-полимераза – фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве матрицы. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с матрицей, с которой ведётся считывание. Собираемая молекула комплементарна матричной моноспирали и идентична второму компоненту двойной спирали. ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с отрезком моноспирали.

Выделяют ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, использующую в качестве матрицы одну из цепей ДНК, и РНК-зависимую ДНК-полимеразу (другое название – обратная транскриптаза), способную также к считыванию информации с РНК (обратная транкрипция).

ДНК-полимераза добавляет свободные нуклеотиды к 3'-концу собираемой цепочки. Это приводит к элонгации цепочки в направлении 5'-3'. Ни одна из известных ДНК-полимераз не может создать цепочку «с нуля»: они в состоянии лишь добавлять нуклеотиды к уже существующей 3'-гидроксильной группе. По этой причине ДНК-полимераза нуждается в праймере, к которому она могла бы добавить первый нуклеотид.

Некоторые ДНК-полимеразы обладают также способностью исправлять ошибки во вновь собираемой цепочке ДНК. Если происходит обнаружение неправильной пары нуклеотидов, ДНК-полимераза откатывается на один шаг назад. Благодаря своему экзонуклеазному действию ДНК-полимераза может исключить неправильный нуклеотид из цепочки и затем вставить на его место правильный, после чего репликация продолжается в нормальном режиме.

Первоначально для ПЦР использовали фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E.coli. Однако недостатком этого фермента являлось то, что после каждого цикла реакции необходимо было вносить в реакционную смесь его новую порцию, поскольку данная полимераза легко инактивировалась при нагревании. Кроме того, в оптимальных температурных условиях такой полимеразной реакции (37°С) появлялись вторичные участки связывания праймеров, и наблюдалась амплификация незапланированных сегментов генома, т. е. специфичность амплификации не была полной. ПЦР стала технологична с началом использования термостабильных ДНК-полимераз, выдерживающих многократный нагрев до 95-96ºС. Первоначально термостабильная ДНК-полимераза была выделена из бактерии Thermus aquaticus, живущей в горячих источниках (Taq-полимераза). В настоящее время эту термостабильную ДНК-полимеразу выделяют из штамма бактерий, специально сконструированного методами генной инженерии.

Используя Taq-полимеразу, удалось решить сразу две проблемы. Во-первых, термостабильная полимераза не инактивируется на этапе денатурации ДНК, и поэтому нет необходимости после каждого цикла реакции добавлять новую порцию фермента. Такое упрощение процедуры позволило автоматизировать проведение ПЦР, так как теперь требовалось лишь перенесение образца с определенным интервалом времени в разные температурные условия: 90-95°С (температура денатурации) и 60-70°С (температура ренатурации ДНК и ферментативной реакции). Во-вторых, высокий температурный оптимум реакции, катализируемой Taq-полимеразой, позволяет подбирать жесткие температурные условия отжига, обеспечивающие гибридизацию праймеров только в заданном районе изучаемого генома, что существенно повышает специфичность и чувствительность метода. Однако и у Taq-полимеразы есть существенный недостаток: из-за отсутствия у этого фермента механизма исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазная активность) вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно велика. Полимеразы Phu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq-полимеразы. Сейчас довольно часто применяют смеси Taq-полимеразы и Phu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

Возможности ПЦР в идентификации ДНК и РНК-содержащих вирусов ещё более возросли с выделением новой полимеразы из термофильного микроорганизма – Thermus thermophilus (Tth-полимераза), обладающей как полимеразной, так и обратно транскриптазной активностью, т.е. способностью синтезировать ДНК на матрице РНК в определенных условиях. Это позволило использовать ее для прямого обнаружения специфических РНК в биологических образцах методом ПЦР. Современные модификации такого подхода дают возможность в одной реакционной смеси (и пробирке) синтезировать в реакции обратной транскрипции небольшое число копий амплифицируемого фрагмента ДНК на матрице РНК, которые сразу же используются тем же ферментом в качестве матрицы в обычной ПЦР (one tube PCR).

Помимо Taq-полимеразы, праймеров и ДНК-матрицы в процессе амплификации участвуют такие компоненты, как ионы магния, 4 типа дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), буферный раствор, агенты, повышающие выход продукта и специфичность реакции и др.

Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), служащие материалом для синтеза ДНК-фрагментов, содержатся в реакционной смеси в эквивалентных концентрациях (200-500 мкМ), так как избыток одного из них увеличивает неспецифическое связывание нуклеотидов. Магний необходим для функционирования фермента Таq-ДНК-полимеразы. Буфер должен обеспечивать оптимальные условия для работы фермента. Наиболее распространен Трис-НСl-буфер, который удерживает рН во время амплификации между 6,8 и 7,8.