I. ПЦР с «горячим стартом» (« hot start »)  

Чтобы уменьшить риск образования неспецифических продуктов реакции амплификации, используют подход, получивший название «горячий старт» («Hot-start»). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.

Существует несколько вариантов реализации «горячего старта»:

1. Внесение в реакционную смесь Taq-полимеразы во время первого цикла после прогрева пробирки до температуры денатурации.

2. Механическое разделение компонентов реакционной смеси парафиновой или восковой прослойкой на два слоя (в нижнем слое праймеры с дНТФ, в верхнем – Taq-полимераза и искомая ДНК), которые смешиваются при расплавлении парафина или воска на стадии денатурации в заранее нагретом амплификаторе.

3. Использование моноклональных антител к Taq-полимеразе. Фермент, связанный моноклональными антителами, приобретает активность после стадии первой денатурации, когда моноклональные антитела денатурируются и освобождают активные центры Taq-полимеразы.

Во всех перечисленных случаях, даже если неспецифический отжиг праймеров произошел до начала температурного циклирования, элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер – ДНК денатурируют, поэтому неспецифические продукты не образуются.

 II. «Гнездовая» (« nested PCR ») ПЦР

Одним из способов повысить чувствительность и уменьшить число побочных продуктов реакции является  применение метода двухступенчатой, так называемой «гнездовой», модификации метода ПЦР («nested PCR») с последовательным использованием внешней и внутренней пар праймеров. Проводят две последовательные реакции. После использования первой пары праймеров в первом раунде ПЦР продукт амплификации переносят в другую пробирку с внутренней парой праймеров и проводят второй раунд ПЦР. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции (рис. 6).

Рис. 6. Схема постановки «nested PCR».

Иногда вместо «гнездной» амплификации используют процесс реамплификации. В этом случае проводят дополнительный раунд ПЦР, в котором используют прежнюю пару праймеров, а в качестве ДНК-мишени – продукт первой реакции амплификации. Праймеры для «nested PCR» подбирают таким образом, чтобы места отжига праймеров для второй ПЦР находились внутри участка ДНК, ограниченного праймерами для первой ПЦР. Таким образом, специфический продукт первой ПЦР может служить матрицей во второй ПЦР, а неспецифические продукты, если они образовались во время первой реакции, выступать в роли матрицы во второй ПЦР не могут.

Такая схема постановки амплификации трудоёмка и требует более строгого соблюдения режима работы в ПЦР-лаборатории, позволяющего гарантированно избежать контаминации лабораторных помещений и реактивов продуктами реакции после использования внешней пары праймеров.

III. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR)

ПЦР с постановкой реакции обратной транскрипции используют для амплификации РНК. Одноцепочечная РНК состоит из неспаренных оснований, способных связываться с новыми комплементарными основаниями. В состав ПЦР-смеси входит короткая последовательность одноцепочечной ДНК, комплементарная последовательности-мишени вирусной РНК. После присоединения праймера к вирусной РНК новые основания присоединяются к праймеру и удлиняют новую цепь ДНК. Для осуществления этого процесса необходим особый фермент, в данном случае Tth-ДНК-полимераза. Процесс продолжается, пока не будет построена новая цепь ДНК, в результате чего получается двухцепочечная структура, состоящая из одной цепи вирусной РНК и одной цепи комплементарной ДНК (кДНК). После образования ДНК может начинаться процесс ПЦР. Новая комбинированная структура РНК/кДНК разделяется при нагревании, в результате чего освобождаются основания ДНК, способные к образованию пар с комплементарными основаниями.

IV . Асимметричная ПЦР (Asymmetric PCR)

 Проводят в целях преимущественной амплифицикации одной из цепей исходной ДНК. Используют в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводят как обычно, за исключением того, что один из праймеров берут в большом избытке.

V . Количественная ПЦР с детекцией в режиме реального времени (Quantitative real-time PCR)

 В этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.