Важным этапом при постановке полимеразной цепной реакции является подготовка исследуемой пробы материала и выделение нуклеиновых кислот с целью очищения их от балластного белка и концентрирования в малом объёме для повышения чувствительности анализа.

В настоящее время не существует универсальной методики экстракции ДНК (РНК) различных видов живых организмов из разнообразных источников. Быстрые методы пробоподготовки, предусматривающие возможность автоматизации, не всегда позволяют достичь требуемого уровня чувствительности ПЦР. С другой стороны, многоэтапные методики, позволяющие тщательно очистить и сконцентрировать ДНК, оказываются трудоемкими и повышающими риск контаминирования образцов.

От эффективности перевода генома возбудителя из исследуемого материала в реакционную смесь ПЦР напрямую зависит достоверность результата. Для проведения ПЦР-анализа необходимо, чтобы геном содержащегося в пробе возбудителя был бы сконцентрирован в минимальном объеме и освобожден от мешающих ПЦР примесей; при этом не требуется получение чистого препарата ДНК.

При отсутствии в пробе ингибиторов ПЦР и наличии достаточного количества матрицы подготовка пробы может быть практически исключена. Однако в большинстве случаев, во избежание получения ложноотрицательных результатов, проводят выделение (экстракцию) нуклеиновых кислот из исследуемого образца биоматериала одним из существующих способов. Как правило, любая экстракция включает специальную обработку, во время которой происходит лизис клеток, устранение белковых и полисахаридных фракций. Современные методики включают этап сорбции ДНК на специальный носитель с последующей ее очисткой и элюцией (Boom R. еt al., 1990).

Сущность процесса состоит в том, что клеточные структуры бактерий и вирусные частицы под действием лизирующего буфера разрушаются, и нуклеиновые кислоты выходят в раствор. Кроме того, лизирующий буфер инактивирует ДНКазы и РНКазы, а также белковые и полисахаридные фракции, присутствующие в пробе и являющиеся ингибиторами ПЦР. Далее к реакционной смеси добавляют сорбент. Нуклеиновые кислоты связываются с частицами сорбента, а обломки клеточных структур и вирусных частиц, инактивированные фракции остаются в растворе. Затем частицы сорбента несколько раз промывают специальными растворами для удаления ингибиторов из реакционной смеси. Далее к раствору частиц сорбента с адсорбированными на них нуклеиновыми кислотами добавляют буфер для разрушения связей между частицами сорбента и очищенными нуклеиновыми кислотами (буфер для элюции), и происходит выделение очищенных нуклеиновых кислот в раствор. Конечный продукт экстракции – очищенные нуклеиновые кислоты, которые в дальнейшем используют для амплификации.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников, которые сорбируют не ДНК, а, наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца, в результате чего клеточные стенки разрушаются, а нуклеиновые кислоты выходят в раствор, и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с биологическим материалом. Однако иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, клеточные стенки некоторых микроорганизмов не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

В настоящее время для контроля этапов выделения и прохождения ПЦР в каждой пробирке некоторые производители тест-систем создают внутренний контрольный образец (ВКО) на основе бактериофага λ. Внутренний контроль – это искусственно сконструированный препарат ДНК или РНК, имеющий те же сайты узнавания праймерами, что и ДНК или РНК возбудителя, но амплифицируемая часть которого отличается по длине в парах нуклеотидов (если метод детекции – электрофоретический анализ), температуре плавления (если метод детекции – анализ кривых плавления ампликонов), нуклеотидной последовательности (если метод детекции – гибридизация).

Как правило, используют «защищенный» ВКО. Преимущество заключается в том, что конструкция ВКО защищена клеточной стенкой бактериофага от действия ДНК–аз; ВКО добавляют в пробу на этапе выделения ДНК, и он является контролем прохождения всех этапов ПЦР –позволяет избежать появление ложноотрицательных результатов, снижающих эффективность ПЦР за счёт контроля удаления из пробы ингибиторов. При достоверном прохождении реакции на электрофореграмме внутренний контроль образует специфический фрагмент, отличающийся по размеру от специфических ампликонов практически в два раза, при гибридизационно-флуоресцентной методе – детекция ВКО проходит по одному из каналов детекции.

Для автоматического выделения нуклеиновых кислот некоторые компании предлагают различное оборудование. В частности, компания Biomerieux (Франция) предлагает систему «NucliSens easyMAG » (фото 4).

Система предназначена для автоматического выделения (очистки и концентрации) нуклеиновых кислот (РНК и ДНК) из 1-24 биологических образцов единовременно. Образец и все реактивы, необходимые для процедуры экстракции нуклеиновых кислот, помещают в стрип и загружают в прибор (фото 5). Далее этапы процедуры экстракции выполняются автоматически.

Образец вносят в лизирующий буфер NucliSens, содержащий гуанидина тиоцианат и тритон X-100. Клеточные структуры и вирусные частицы под действием лизирующего буфера разрушаются, и нуклеиновые кислоты выходят в раствор. Лизирующий буфер NucliSens инактивирует РНКазы и ДНКазы, присутствующие в образце.

Далее к реакционной смеси добавляют силикагель. Нуклеиновые кислоты реакционной смеси связываются с частицами силикагеля. Обломки клеточных структур и вирусных частиц остаются в растворе. Затем частицы силикагеля несколько раз промывают буферами для экстракции, и обломки клеточных структур и вирусных частиц удаляют из реакционной смеси. К раствору частиц силикагеля с адсорбированными на них нуклеиновыми кислотами добавляют буфер для разрушения связей между частицами силикагеля и очищенными нуклеиновыми кислотами, и происходит элюция очищенных нуклеиновых кислот в раствор.

Прибор, контролируемый компьютерным модулем, автоматически выполняет требуемые операции.

Большим преимуществом данной системы является возможность выделения как ДНК, так и РНК микроорганизмов, а также исходный объём исследуемой пробы, который может составлять от 100 мкл до 1 мл (при ручном выделении нуклеиновых кислот объём пробы составляет 100-200 мкл). Таким образом, при автоматическом выделении нуклеиновых кислот в несколько раз повышается чувствительность и информативность исследуемых проб.

Для автоматического выделения нуклеиновых кислот возможно использование разного биологического материала: цельная кровь, моча, фекалии, смывы, суспензия патматериала.