Д.В. Кравченко¹ , Н.А. Федуро² , О.В. Сергиевич² , И.Б. Тарас²

¹ ГУ «РНПЦ радиационной медицины и экологии человека», г. Гомель, Беларусь

² ГУ «РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий», г. Минск, Беларусь

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) – это наиболее распространенный вид лейкоза взрослых в странах Европы и Северной Америки. Ежегодная заболеваемость ХЛЛ в этих странах составляет 3-3,5 на 100 000 населения, а среди лиц старше 65 лет – до 20 на 100 000. Средний возраст к началу заболевания составляет 65 лет. Если учесть, что 10 % пациентов заболевает в более раннем возрасте (около 40 лет), то можно считать, что значимая часть пациентов относится к людям трудоспособного возраста. Несмотря на существование достаточного количества схем химиопрепаратов, при использовании которых достигается ремиссия длительностью до 3-4 лет, у определенных групп пациентов с ХЛЛ наблюдается первичная или вторичная рефрактерность к терапии некоторыми химиопрепаратами. Показатели выживаемости таких пациентов почти не изменились и соответствуют показателям того времени, когда любое лечение было менее эффективным. Так, по данным литературы, клиническая резистентность к флударабину отмечается у 25-30% первичных пациентов с ХЛЛ. У пожилых пациентов с медленно протекающим ХЛЛ, часть из которых длительное время вообще не нуждается в терапии, и более молодых с продвинутой стадией заболевания (С по Biet) необходим дифференцированный подход в плане выбора полихимиотерапии (ПХТ). Проблема терапии группы пациентов ХЛЛ высокого риска (рефрактерного ХЛЛ) в настоящее время представляется ключевой. Поэтому знание чувствительности опухолевых клеток к определенным химиопрепаратам делает возможным проводить терапию данной группы пациентов значительно успешней.

Нами было проведено пилотное исследование, включавшее 14 пациентов с диагнозом ХЛЛ, обследованных на базе ГУ «РНПЦ РМ и ЭЧ» (г. Гомель) с ноября 2015 года по февраль 2016 года. Материалом для исследования послужила венозная кровь пациентов с диагнозом ХЛЛ. Определение индивидуальной чувствительности опухолевых лимфоцитов к химиопрепаратам in vitro с помощью МТТ-теста выполнялось в лаборатории механизмов клеточной лекарственной резистентности на базе ГУ «РПНЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий» (г. Минск).

Для определения индивидуальной чувствительности опухолевых лимфоцитов к химиопрепаратам эти клетки инкубируются в отсутствии (контроль) или в присутствии близких к терапевтическим концентраций исследуемых цитостатических химиопрепаратов. После 44 ч культивирования клеток и исследуемых препаратов в питательной среде при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂, в каждую лунку добавляется 3-[4,5-диметилтиазолил-2-ел]-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ). Через 4 ч экспозиции при 37°С живые клетки восстанавливают желтый МТТ до темно-фиолетовых гра нул формазана. Гранулы формазана растворяются в изопропаноле, количест во восстановленного продукта измеряется фотометрически при длине волны 540 нм. Выживаемость лейкозных клеток в присутствии исследуемого лекарственного препарата рассчитывается по специальной формуле и выражается в процентах выживших клеток. Все исследуемые образцы лимфоцитов классифицировались по ответу на химиопрепараты: 1. Очень высокая чувствительность (выживаемость лимфоцитов в МТТ-тесте <15%); 2. Высокая чувствительность (выживаемость клеток 15-39%); 3. Умеренная чувствительность (выживаемость клеток 40-59%); 4. Низкая чувствительность (выживаемость клеток 60-89%); 5. Резистентность (выживаемость клеток 90% и ).

Статистическая обработка полученных данных производилась в пакете программ «Statistica 10.0».

У 11 (78,6%) пациентов заболевание было в стадии С по Biet, у 3 (21,4%) пациентов – в стадии В. Мужчин из них 8 (57,1%) человек, женщин – 6 (42,9%). Ранее получавших ПХТ было 10 (71,4%) пациентов, не получавших ранее ПХТ – 4 (28,6%) пациента, один из которых получал монотерапию лейкераном (хлорамбуцилом), трое ничего ранее не получали.

Было выявлено, что у обследованных пациентов чувствительность к представленным химиопрепаратам имеет статистически значимые различия (р≤0,05). Согласно полученным данным, опухолевые клетки обладали высокой чувствительностью к следующим химиопрепаратам: этопозид Ме (Q₁; Q₂) – (25,6% (19,3-49,4)), митоксантрон (27,1% (19,3-34,2)), циклофосфан (28,2% (21,7-60,5)), лейкладин (32,6 (24,543)), рубомицин (34,4% (22,2-60)), флударабел (35,9% (25,7-61)). Ряд препаратов характеризовались низкой эффективностью в отношении опухолевых клеток (низкая чувствительность): мелфалан (87,2 % (73,789,2)), дексаметазон (80,8% (46,9-83)), аспарагиназа (69,3% (60,5-80,4)), иматиниб (67,3% (57,8-72,1)), преднизолон (65,5% (44-67,3)). При этом такой часто используемый при ХЛЛ препарат, как Мабтера, в нашем исследовании также не показал высокой эффективности в отношении действия против опухолевых клеток (выживаемость клеток 73,5% (64,1-78,5)). К двум химиопрепаратам опухолевые клетки оказались практически полностью резистентными: меркаптопурин (99,1% (60-99,9)) и кармустин (90,1% (88,5-93,6)). К остальным исследуемым цитостатикам отмечалась умеренная чувствительность опухолевых лимфоцитов: цитарабин, винкристин, бортезомиб, доксорубицин, хлорамбуцил, цисплатин.

Нами были выявлены сильные корреляционные связи по степени чувствительности к следующим химиопрепаратам: выживаемость лимфоцитов в МТТ-тесте при использовании препарата флударабел коррелировала с циклофосфаном (r0,89;р0,00001), преднизолоном (r0,79; р0,004) и рубомицином (r0,82; р0,0003); чувствительность к циклофосфану коррелировала с чувствительностью к митоксантрону (r0,91;р0,000007), преднизолону (r0,78; р0,0006), рубомицину (r0,83; р0,0002) и аспарагиназе (r0,82;р0,0006); чувствительность к митоксантрону коррелировала с чувствительностью к дексаметазону (r0,83; р0,0003), рубомицину (r0,76; р0,0015) и аспарагиназе (r0,88; р0,00006); чувствительность к преднизолону (кроме вышеперечисленных) коррелировала с чувствительностью к дексаметазону (r0,82; р0,0003) и аспарагиназе (r0,75; р0,003); чувствительность клеток к винкристину коррелировала с чувствительностью к этопозиду (r0,86; р0,00007) и мабтере (r-0,91; р0,00003); чувствительность клеток к хлорамбуцилу коррелировала с чувствительностью к бортезомибу (r0,81; р0,0008).

Можно полагать, что проведение дальнейших исследований по разработке индивидуализированного подхода к доклинической диагностике лекарственной чувствительности клеток с сопоставлением эффективности лечения пациентов с диагнозом ХЛЛ приведет к повышению эффективности терапии данной патологии, увеличению продолжительности ремиссии, снижению частоты рецидивов заболевания. При этом может быть получен положительный экономический эффект за счет снижения использования в конкретных случаях признанных схем химиотерапии, к которым пациенты оказываются нечувствительными.