ГУ «РНПЦ радиационной медицины и экологии человека», г. Гомель, Беларусь

Рак желудка – одна из частых причин смертности в мире от злокачественных заболеваний. Инфекция H . pylori является установленным фактором риска возникновения предраковых заболеваний и рака желудка. Кроме того, исследователи разных стран изучают ассоциации между полиморфизмами генов интерлейкинов и риском развития рака желудка, язвенной болезни, гастрита и МАT-лимфомы.

Семейство генов I-1 включает три интерлейкина: I -1α, I-1 βи I-1N, которые кодируют противовоспалительные цитокины I-1α, I-1β и эндогенный противовоспалительный цитокин (антагонист рецептора I-1) I-1а, вырабатываемый моноцитами, макрофагами, нейтрофилами и гепатоцитами. Ген I-1N имеет пента–аллельную 86 п.н. переменную тандемную дупликацию в интроне 2 (NT). Связываясь с рецептором I-1 антагонист препятствует активации внутриклеточного сигнального каскада и увеличивает секрецию I-1β. Имеются данные об ассоциации полиморфизма гена I-1N и риском возникновения карциномы желудка. Интерлейкин 1β является основной формой I-1 и отвечает за развитие и регуляцию неспецифической защиты и специфического иммунитета, одним из первых включается в ответную защитную реакцию организма при действии патогенных факторов. Основными продуцентами I-1β являются макрофаги и моноциты. Известен полиморфизм гена I-1β в позициях 511(С→T), 31(Т→С) и +3953(С→T). Наличие полиморфных вариантов гена I-1 β приводит к высокому уровню экспрессии цитокина, снижению секреции кислоты, преобладанию колонизации H .pylori в теле желудка, в результате чего развивается пангастрит и формируется атрофический гастрит. Ассоциация увеличения риска развития рака желудка и полиморфизма I-1β С511T наблюдается во многих исследованиях, тем не менее есть сообщения об этнических отличиях (N. Matsukura, 2003; И.В. Маев, 2008). Таким образом, целью настоящего исследования является поиск ассоциации функционального полиморфизма 511(С→T) в промоторном участке гена I-1β и полиморфизма NT в гене I-1N с риском развития гастрита и рака желудка у белорусов.

В качестве материала для исследования использовались биоптаты cлизистой оболочки желудка (СОЖ) и цельная кровь 250 пациентов (средний возраст (медиана и квартили) 52 (37, 62) года с хроническим гастритом (ХГ) и 72 пациентов (средний возраст 67 (58, 74) лет), с раком желудка (РЖ). Все обследуемые пациенты согласно данных анкетирования являлись белорусами. Кровь для проведения исследований забирали из локтевой вены одноразовой иглой в специальную вакуумную систему типа «acuette» с ЭДТА, проводили обработку и получали плазму и лейкоцитарную массу. Выделение тотальной ДНК проводили сорбционным методом на колонках с использованием протеиназы К. После проведения выделения количество ДНК определяли фотометрически; препараты ДНК, отвечающие стандартным требованиям, использовали для проведения аллельспецифичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции с определением длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).

Реакционная смесь состояла из 2,5-х кратного ПЦР-буфера (ксиленцианол, 7,5 мМ MgCl2, Tagполимераза), смеси нуклеотидов дНТФ10 мМ, cмеси праймеров10 Мм и деионизованной воды. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл, количество исходной ДНК с концентрацией 20 нг/мкл ДНК – 2 мкл.

Для определения ДНК H . Pylori использовали последовательность праймеров (5’-ggctatgacgggtatccggc- 3’, 5’-gccgtgcagcacctgtttc-3’); сagA гена(5’-gataacaggcaagcttttgaggga-3’, 5’-ctgcaaaagattgtttggcaga-3’);I-1β(С511T) (5’-tggcattgactggttcatc-3’, 5’-gtttaggaatcttcccactt-3’); I-1N (5’-cccctcagcaacactcc-3’, 5’-ggtcagaagggcagaga-3’).

Амплификацию проводили в амплификаторе PalmCycler фирмы Corbettesearch (Австралия) в соответствии со стандартным режимом амплификации и температурой отжига (Tm) используемых праймеров. Температура отжига для определения ДНК H . pylori составила 63°С, сagA – 55°С, I-1β С511T – 55°С, I-1 N – 60°С. ПЦР-ПДРФ для определения полиморфизма гена I-1β С511T проводили с использованием рестриктазы AvaI (Eco 88I ) в соответствии с инструкцией по применению.

Для детекции продуктов амплификации использовали метод электрофореза в 2% агарозном геле по стандартной схеме c визуализацией полученных результатов при помощи видеосистемы.

Распределение частот генотипов и аллелей оценивали в соответствии с равновесием Харди–Вайнберга и c использованием программного пакета STATISTICA 6.0.

В результате проведенного исследования специфическая фракция размером 765 п.н., характеризующая присутствие ДНК H . pylori в анализируемой пробе, выявлена в 136 (54,4 %) из 250 исследуемых препаратов ДНК пациентов ХГ и в 41 (56,9 %) РЖ, что свидетельствует об отсутствии статистически значимых различий в инфицированности между группами. В группе РЖ наблюдается статистически значимая разница выявления образцов, cодержащих сagA положительный генотип (45,8%), по сравнению с группой ХГ (32,4%), уровень значимости различий χ² 0,036.

Анализ частот генотипов I–1 N иI-1β С511Tв группах пациентов ХГ и РЖ показал, что распределение генотипов соответствует равновесию Харди–Вайнберга для всех полиморфизмов. Различия по частотам генотипов для изучаемых полиморфизмов интерлейкинов между группами пациентов ХГ и РЖ статистически значимы для I–1 N (χ² 0,012) и незначимы для I–1β C511T(χ² 0,899).

Попарное сравнение частот генотипов I-1N позволило выделить наиболее информативный в отношении риска развития рака желудка генотип 1/1 (χ² 0,003, ОШ 2,21, 95% ДИ 1,29-3,76). Диагностическая чувствительность выявления данного генотипа составила 51,4%, диагностическая специфичность 67,6%.

Ассоциации генотипов изучаемых интерлейкинов с наличием атрофии слизистой желудка в группе пациентов ХГ не выявлено (χ² 0,479 для I1 N и χ² 0,814 для I-1β С511T).

Выявление различий по частотам генотипов в зависимости от степени активности ХГ показало статистически значимые различия в частотах генотипов интерлейкина I-1N (χ²0,031)и большую частоту генотипа 2/2 (χ²0,021, ОШ2,37, 95% ДИ 1,12-5,02) среди пациентов с умеренно/высокоактивным ХГ.

Инфицирование сagA содержащими штаммами H . pylori коррелировало с наличием генотипа СТ I-1β C511T (χ²0,005, ОШ 2,21, 95% ДИ 1,29-3,76)и генотипа 2/2 I-1N (χ²0,034, ОШ 2,2, 95% ДИ 1,05-4,62).

Настоящее исследование установило ассоциацию с риском развития высокоактивного гастрита и рака желудка у белорусов генотипов I1-N (1/1 и 2/2) и I-1β C511T (CT), влияющих на выработку белков и характеризующих протекание патологического процесса. В ответ на инфицирование H . pylori, особенно сagA содержащими штаммами, макрофаги усиленно синтезируют провоспалительный I-1β. I-1β взаимодействует с клетками через рецептор-антагонист A I-1, конкурентно связывает этот цитокин, оказывает противовоспалительное действие, что способствует развитию атрофии.

Таким образом, сочетание аллелей I-1N (1/1 и 2/2) и I-1β-511 (СT) повышает риск развития рака желудка. Определение данных полиморфных локусов генов I1-N и I-1β может быть хорошим диагностическим дополнением при индивидуальной оценке прогноза течения и тяжести заболевания.