киРНК — «шаблоны» для поиска в цитоплазме и уничтожения молекул мРНК — имеют длину 20–25 нуклеотидов и «особую примету»: по 2 неспаренных нуклеотида на 3′-концах и фосфорилированные 5′-концы. Анти-смысловая киРНК способна (не сама, конечно, а с помощью RISC-комплекса) распознавать мРНК и специфически вызывать её деградацию : разрез целевой мРНК всегда происходит точно в месте, комплементарном 10 и 11 нуклеотидам анти-смысловой цепи киРНК.

Механизм «интерференции» мРНК и киРНК. «Интерферирующие» короткие молекулы РНК могут как попадать в клетку извне, так и «нарезаться» уже на месте из более длинных двуцепочечных РНК. Основной белок, необходимый для «нарезания» дцРНК, — эндонуклеаза Dicer . «Выключение» гена по механизму интерференции осуществляется киРНК совместно с белковым комплексом RISC , который состоит из трёх белков — эндонуклеазы Ago 2 и двух вспомогательных белков PACT и TRBP . Позже было обнаружено, что комплексы Dicer и RISC могут использовать в качестве «затравки» не только дцРНК, но и одноцепочечную РНК, формирующую двуцепочечную шпильку, а также готовую киРНК (последняя минует стадию «нарезания» и сразу связывается с RISC ).

МикроРНК Предшественник микроРНК транскрибируется с обеих цепей геномной ДНК РНК-полимеразой II, в результате чего появляется промежуточная форма — при-микроРНК, — несущая признаки обычной мРНК — m7G-кэп и полиА-хвост. В этом предшественнике образуется петля с двумя одноцепочечными «хвостами» и несколькими неспаренными нуклеотидами в центре . Такая петля подвергается двухстадийному процессингу : вначале эндонуклеаза Drosha отрезает от шпильки одноцепочечные «хвосты» РНК, после чего вырезанная шпилька (пре-микроРНК) экспортируется в цитоплазму, где узнается Dicer’ом, вносящим ещё два разреза. В таком виде зрелая микроРНК, аналогично киРНК, включается в состав комплекса RISC. Механизм действия многих микроРНК аналогичен действию киРНК: короткая (21–25 нуклеотидов) одноцепочечная РНК в составе белкового комплекса RISC с высокой специфичностью связывается с комплементарным участком в 3′-нетранслируемой области мРНК-мишени. Связывание приводит к расщеплению мРНК белком Ago. Однако активность микроРНК (по сравнению с киРНК) уже более дифференцирована — если комплементарность не абсолютная, целевая мРНК может не деградировать, а только обратимо блокироваться (трансляции не будет).

16 Дайте характеристику рестриктаз как белков, защищающих бактерии от чужеродных ДНК (фагов, плазмид). Применение рестриктаз в генной инженерии. Получение «библиотек» ДНК, клонирование фрагментов ДНК «методом дробовика».

Рестриктазы — это особые ферменты, способные разрезать цепочки ДНК в строго определенных местах. Именно в специфичности действия заключается главное отличие данной группы белков от других видов эндонуклеаз. Благодаря этому уникальному свойству ферменты рестрикции нашли широкое применение в генной инженерии. Рестриктазы — это уникальные ферменты бактерий. Впервые эти белки были выделены в 1968 году из штаммов Esherihia colli. Дальнейшие исследования выявили присутствие эндонуклеаз рестрикции в одноклеточной водоросли Chlorella, а также в нескольких культурах дрожжей Sachoromyces и Pichia. В клетках других эукариотов рестриктазы пока не обнаружены. Рестриктазы — ферменты, относящиеся к группе гидролаз, поскольку катализируют гидролиз фосфодиэфирной связи между нуклеотидами в цепочке ДНК. Место, в котором происходит разрезание, называется сайтом рестрикции .

Бактерии рестриктазы — это важнейший инструмент защиты клетки от бактериофагов. Основная задача ферментов данной группы состоит в разрезании проникшего в клетку чужеродного генетического материала. Фрагментирование нуклеиновой кислоты препятствует ее репликации, а значит, и размножению вируса. Последовательности, к которым специфичны рестриктазы, с определенной периодичностью встречаются в геноме самой бактерии и потому подвергаются метилированию, которое не позволяет рестриктазам распознать свои мишени. Этот процесс осуществляется ферментами метилазами. Механизм, направленный на разрезание чужеродной ДНК и защищающий от нуклеазной активности собственную, называется системой рестрикции-модификации. Некоторые типы рестриктаз способны проявлять как эндонуклеазную, так и метилазную активность.