Структура Kell-гликопротеина
Поможем в ✍️ написании учебной работы
Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

 

Redman и соавт. [320, 325] с помощью иммунопреципитации выделили из мем-браны меченных радиоактивным йодом эритроцитов гликопротеины с мол. мас-сой 93 кДа. Для этого авторы адсорбировали на эритроцитах антитела анти-K, анти-k, анти-Js b и анти-K22, после чего оболочку эритроцитов растворяли трито-ном Х-100. Далее белковый субстрат и адсорбированные на нем антитела разделяли. Выделенные гликопротеины оказались гликопротеинами Kell, поскольку содержали Kell-антигены. Аналогичные гликопротеины выделили Wallas и соавт. [389], добавляя анти-K-антитела к растворенным тритоном Х-100 мембранам эритроцитов K +.

При электрофорезе редуцированного (сульфгидрированного) иммунопреципи-тата в полиакриламидном геле (ПААГ) Redman и соавт. наблюдали полосу, мечен-ную радиоактивным йодом, образованную субстратом с мол. массой 93 кДа. При электрофорезе в ПААГ нередуцированного иммунопреципитата авторы получили несколько полос, образованных субстратами с мол. массой 85–90 кДа, 115–130 кДа

у еще более высокомолекулярным субстратом, который не проникал в 7,5 % ПААГ. Вырезав каждую из этих полос и повторно подвергнув электрофорезу субстрат в редуцирующих условиях, авторы показали, что каждая полоса содержала компо-нент 93 кДа. Результаты эксперимента указывали на то, что белок Kell связан дис-ульфидными связями с другим белком, имеющим мол. массу около 40 кДа. Когда Redman и соавт. [326] установили, что белок Kx имеет мол. массу 37 кДа, было вы-сказано мнение, что Kx ковалентно связан с белком Kell, и это вскоре было под-тверждено исследованиями Parsons и соавт. [303], Jaber и соавт. [210], Khamlichi [224], которые использовали для иммунопреципитации наряду с поликлональными человеческими антителами моноклональные мышиные Kell-антитела.

Kell-гликопротеины отсутствовали в иммунопреципитатах из эритроцитов Ko при использовании различных поли- и моноклональных Kell-антител, в том числе антител, полученных иммунизацией мышей и кроликов очищенным Kell-гликопротеином [211, 320].

Kell-антитела слабо реагировали с изолированным Kell-гликопротеином в иммуноблоттинге, хотя мышиные и кроличьи моноклональные антитела, полу-ченные иммунизацией животных Kell-гликопротеином, выявляли гликопротеин с мол. массой 93 кДа [211, 310].

 

Далее было показано, что все Kell-антигены, за исключением K24, распола-

 

гаются на Kell-гликопротеине [210, 213, 215, 269, 307, 310].

 

Другой из выделенных гликопротеинов был охарактеризован как Kx-протеин. Последний тесно связан в мембране с Kell-гликопротеином и преципитируется вместе с ним в виде гетеродимера [224]. Оба белка соединены дисульфидными связями через цистеин 72, расположенный на Kell-гликопротеине и одновременно занимающий позицию 347 на Kx-протеине [111, 333] (см. рис. 5.1).

 

Marsh и Redman [268], Redman и соавт. [323] предположили, что Kell-

 

антигены размещаются на гликопротеине с N-гликанами, поскольку обработка Kell-гликопротеина N-гликаназой редуцировала Kell-гликопротеин до 79 кДа,


 

367


отщепляя от него цепь с мол. массой около 15 кДа. В то же время О-гликаназа практически не редуцировала Kell-гликопротеин.

 

и иммуноблоттинге K-активный гликопротеин мигрировал быстрее, чем k-активные гликопротеиновые молекулы. Считается, что первый субстрат менее гликозилирован, чем второй. Этим различием в гликозилировании объясняют более сильную иммуногенность K по сравнению с другими антигенами системы Kell [141].

Carbonnet и соавт. [120, 121] отметили, что Kell-гликопротеины фосфорили-руются, но не пальмитируются. Примерно 12 % массы Kell-гликопротеина со-ставляют углеводы – N-связанные олигосахариды, размещающиеся на экстра-целлюлярной части гликопротеина [210]. O-связанные олигосахариды практи-чески отсутствуют. Остальная часть Kell-гликопротеина представлена белком.

 



Структура Kell-протеина

 

Структура очищенного от углеводов Kell-полипептида исследована Lee и со-авт. [242, 243]. Этот белок является мембранным протеином II типа, имеет мол. массу 82,8 кДа и состоит из 732 аминокислот (рис. 5.2).

 

1 MEGGDQSEEE

PRERSQAGGM

GTLWSQESTP

EERLPVEGSR

PWAVARRVLT

50  
51 ATLILGLLLC

FSVLLFYNGQ

NCGPRCETS

VCLDLRDHYL  

ASGNTSVAPC

100  

101

TDFFSFACGR

AKETNNSFQE

LATKNKNRLR

RILEVQNSWH

           

150

 

PGSGEEKAFQ

 

151

FYNSCMDTLA

     

QVIEELGGWR

ISGKWTSLNF

 

NRTLRLLMSQ

200

 

IEAAGTGPLR

   
201 YGHFPFFRAY

LGPHPASPHT

PVIQIDQPEF

DVPLKQDQEQ    

KIYAQIFREY

250  
251 LTYLNQLGTL

LGGDPSKVQE

HSSLSISITS

RLFQFLRPLE

QRRAQGKLFQ

300  
301 MVTIDQLKEM

APAIDWLSCL

QATFTPMSLS

PSQSLVVHDV  

EYLKNMSQLV

350  

351

EEMLLKQRDF

LQSHMILGLV

VTLSPALDSQ

FQEARRKLSQ

 

   

400

 

KLRELTEQPP

 
401 MPARPRWMKC

VEETGTFFEP

TLAALFVREA

FGPSTRSAAM

KLFTAIRDAL

450  
451 ITRLRNLPWM

NEETQNMAQD

KVAQLQVEMG

ASEWALKPEL

ARQEYNDIQL

500  
501 GSSFLQSVLS

CVRSLRARIV

QSFLQPHPQH

RWKVSPWDVN

AYYSVSDHVV

550  
551 VFPAGLLQPP

FFHPGYPRAV

NFGAAGSIMA

HELLHIFYQL

LLPGGCLACD

600  
601 NHALQEAHLC

LKRHYAAFPL

PSRTSFNDSL

TFLENAADVG  

GLAIALQAYS

650  

651

KRLLRHHGET

VLPSLDLSPQ

         

MCRKPSPQDS

HDTHSPPHLR

700

 

QIFFRSYAQV

 
701 VHGPLSSTPA

FARYFRCARG

ALLNPSSRCQ

LW             732  
                                     

 

Рис. 5.2. Аминокислотная последовательность Kell-протеина по Lee и соавт. [242, 243 ]. Полужирным шрифтом выделен гидрофобный участок трансмембранного домена, полу-

 

жирным шрифтом с подчеркиванием – участки N-гликозилирования.

 

Аминокислотная последовательность, обусловливающая специфичность Kell-антигенов, имеет большое сходство с аминокислотной последовательностью цин-ксвязывающих эндопептидаз [135, 234], найденных почти у всех животных [214]. Эти эндопептидазы, широко представленные в клетках и тканях, участвуют в пре-вращении, главным образом инактивации пептидных гормонов, таких как энцефа-лин, нейротензин, ангиотензин, окситоцин, брадикинин. В противоположность эн-допептидазам, присутствующим во многих клетках, Kell-протеин экспрессиру-ется только в эритроидных клетках [244], осуществляя, возможно, некое предста-вительство цинксвязывающих эндопептидаз на эритроцитах. Не исключено, что указанное сходство обеспечивает определенные физиологические функции Kell-полипептида на мембране эритроцитов, связанные с транспортом гормонов.

 

Белок Kell практически повторяет аминокислотную последовательность


 

368


эндотелин-конвертирующего энзима 1 и 2 (ЭКЭ-1 и ЭКЭ-2) и нейтральной эн-допептидазы-24-11 (CD10). Эти белки образуют подсемейство мембранных металлопротеиназ М13. Структурная модель Kell-гликопротеина, представ-ленная выше (см. рис. 5.1), построена на основе структурной модели ЭКЭ-1.

 

Kell-полипептид имеет небольшой гидрофобный внутримембранный домен, высокогидрофильный N-терминальный цитоплазматический домен, состоящий из 27–47 аминокислот, и большой С-терминальный экстрацеллюлярный домен, состоящий из 665 аминокислот.

 

Внеклеточная часть Kell-полипептида содержит 6 гликозилируемых участ-ков (позиции 94, 115, 191, 345, 627 и 724), хотя считается, что аспарагин 724 не пригоден для гликозилирования на участке 6, поскольку расположенный рядом пролин 725 ингибирует гликозилирование.

 

и экстрацеллюлярном домене Kell-полипептида имеется 15 цистеиновых остатков, предполагающих наличие 7 дисульфидных связей, что согласуется с имеющимися данными о высокой чувствительности антигенов Kell к тиоловым реагентам (Branch и соавт. [109]). В трансмембранной области имеется допол-нительный цистеиновый остаток.

 

Redman и Lee [322] считают, что цистеиновые остатки, располагающиеся вдоль молекулы, нужны для поддержания вторичной структуры Kell-протеина. Согласно концепции авторов, экстрацеллюлярная часть Kell-протеина состоит из двух доменов, соединенных между собой дисульфидными связями и отделя-ющихся один от другого длинным пептидным сегментом. Цистеиновый оста-ток в позиции 72 Kell-протеина обеспечивает сцепление с цистеиновым остат-ком в позиции 347 Kx-протеина [333], формируя таким образом Kell-иммуноген полной длины. В то же время антитела к Kell-протеину удалось получить имму-низацией кроликов коротким пептидом, состоящим из 30 аминокислот, который был синтезирован с помощью кДНК клеток костного мозга человека.

 



Дата: 2019-02-24, просмотров: 216.