Redman и соавт. [320, 325] с помощью иммунопреципитации выделили из мем-браны меченных радиоактивным йодом эритроцитов гликопротеины с мол. мас-сой 93 кДа. Для этого авторы адсорбировали на эритроцитах антитела анти-K, анти-k, анти-Js b и анти-K22, после чего оболочку эритроцитов растворяли трито-ном Х-100. Далее белковый субстрат и адсорбированные на нем антитела разделяли. Выделенные гликопротеины оказались гликопротеинами Kell, поскольку содержали Kell-антигены. Аналогичные гликопротеины выделили Wallas и соавт. [389], добавляя анти-K-антитела к растворенным тритоном Х-100 мембранам эритроцитов K +.

При электрофорезе редуцированного (сульфгидрированного) иммунопреципи-тата в полиакриламидном геле (ПААГ) Redman и соавт. наблюдали полосу, мечен-ную радиоактивным йодом, образованную субстратом с мол. массой 93 кДа. При электрофорезе в ПААГ нередуцированного иммунопреципитата авторы получили несколько полос, образованных субстратами с мол. массой 85–90 кДа, 115–130 кДа

у еще более высокомолекулярным субстратом, который не проникал в 7,5 % ПААГ. Вырезав каждую из этих полос и повторно подвергнув электрофорезу субстрат в редуцирующих условиях, авторы показали, что каждая полоса содержала компо-нент 93 кДа. Результаты эксперимента указывали на то, что белок Kell связан дис-ульфидными связями с другим белком, имеющим мол. массу около 40 кДа. Когда Redman и соавт. [326] установили, что белок Kx имеет мол. массу 37 кДа, было вы-сказано мнение, что Kx ковалентно связан с белком Kell, и это вскоре было под-тверждено исследованиями Parsons и соавт. [303], Jaber и соавт. [210], Khamlichi [224], которые использовали для иммунопреципитации наряду с поликлональными человеческими антителами моноклональные мышиные Kell-антитела.

Kell-гликопротеины отсутствовали в иммунопреципитатах из эритроцитов K_o при использовании различных поли- и моноклональных Kell-антител, в том числе антител, полученных иммунизацией мышей и кроликов очищенным Kell-гликопротеином [211, 320].

Kell-антитела слабо реагировали с изолированным Kell-гликопротеином в иммуноблоттинге, хотя мышиные и кроличьи моноклональные антитела, полу-ченные иммунизацией животных Kell-гликопротеином, выявляли гликопротеин с мол. массой 93 кДа [211, 310].

Далее было показано, что все Kell-антигены, за исключением K24, распола-

гаются на Kell-гликопротеине [210, 213, 215, 269, 307, 310].

Другой из выделенных гликопротеинов был охарактеризован как Kx-протеин. Последний тесно связан в мембране с Kell-гликопротеином и преципитируется вместе с ним в виде гетеродимера [224]. Оба белка соединены дисульфидными связями через цистеин 72, расположенный на Kell-гликопротеине и одновременно занимающий позицию 347 на Kx-протеине [111, 333] (см. рис. 5.1).

Marsh и Redman [268], Redman и соавт. [323] предположили, что Kell-

антигены размещаются на гликопротеине с N-гликанами, поскольку обработка Kell-гликопротеина N-гликаназой редуцировала Kell-гликопротеин до 79 кДа,

367

отщепляя от него цепь с мол. массой около 15 кДа. В то же время О-гликаназа практически не редуцировала Kell-гликопротеин.

и иммуноблоттинге K-активный гликопротеин мигрировал быстрее, чем k-активные гликопротеиновые молекулы. Считается, что первый субстрат менее гликозилирован, чем второй. Этим различием в гликозилировании объясняют более сильную иммуногенность K по сравнению с другими антигенами системы Kell [141].

Carbonnet и соавт. [120, 121] отметили, что Kell-гликопротеины фосфорили-руются, но не пальмитируются. Примерно 12 % массы Kell-гликопротеина со-ставляют углеводы – N-связанные олигосахариды, размещающиеся на экстра-целлюлярной части гликопротеина [210]. O-связанные олигосахариды практи-чески отсутствуют. Остальная часть Kell-гликопротеина представлена белком.

Структура Kell-протеина

Структура очищенного от углеводов Kell-полипептида исследована Lee и со-авт. [242, 243]. Этот белок является мембранным протеином II типа, имеет мол. массу 82,8 кДа и состоит из 732 аминокислот (рис. 5.2).

Рис. 5.2. Аминокислотная последовательность Kell-протеина по Lee и соавт. [242, 243 ]. Полужирным шрифтом выделен гидрофобный участок трансмембранного домена, полу-

жирным шрифтом с подчеркиванием – участки N-гликозилирования.

Аминокислотная последовательность, обусловливающая специфичность Kell-антигенов, имеет большое сходство с аминокислотной последовательностью цин-ксвязывающих эндопептидаз [135, 234], найденных почти у всех животных [214]. Эти эндопептидазы, широко представленные в клетках и тканях, участвуют в пре-вращении, главным образом инактивации пептидных гормонов, таких как энцефа-лин, нейротензин, ангиотензин, окситоцин, брадикинин. В противоположность эн-допептидазам, присутствующим во многих клетках, Kell-протеин экспрессиру-ется только в эритроидных клетках [244], осуществляя, возможно, некое предста-вительство цинксвязывающих эндопептидаз на эритроцитах. Не исключено, что указанное сходство обеспечивает определенные физиологические функции Kell-полипептида на мембране эритроцитов, связанные с транспортом гормонов.

Белок Kell практически повторяет аминокислотную последовательность

368

эндотелин-конвертирующего энзима 1 и 2 (ЭКЭ-1 и ЭКЭ-2) и нейтральной эн-допептидазы-24-11 (CD10). Эти белки образуют подсемейство мембранных металлопротеиназ М13. Структурная модель Kell-гликопротеина, представ-ленная выше (см. рис. 5.1), построена на основе структурной модели ЭКЭ-1.

Kell-полипептид имеет небольшой гидрофобный внутримембранный домен, высокогидрофильный N-терминальный цитоплазматический домен, состоящий из 27–47 аминокислот, и большой С-терминальный экстрацеллюлярный домен, состоящий из 665 аминокислот.

Внеклеточная часть Kell-полипептида содержит 6 гликозилируемых участ-ков (позиции 94, 115, 191, 345, 627 и 724), хотя считается, что аспарагин 724 не пригоден для гликозилирования на участке 6, поскольку расположенный рядом пролин 725 ингибирует гликозилирование.

и экстрацеллюлярном домене Kell-полипептида имеется 15 цистеиновых остатков, предполагающих наличие 7 дисульфидных связей, что согласуется с имеющимися данными о высокой чувствительности антигенов Kell к тиоловым реагентам (Branch и соавт. [109]). В трансмембранной области имеется допол-нительный цистеиновый остаток.

Redman и Lee [322] считают, что цистеиновые остатки, располагающиеся вдоль молекулы, нужны для поддержания вторичной структуры Kell-протеина. Согласно концепции авторов, экстрацеллюлярная часть Kell-протеина состоит из двух доменов, соединенных между собой дисульфидными связями и отделя-ющихся один от другого длинным пептидным сегментом. Цистеиновый оста-ток в позиции 72 Kell-протеина обеспечивает сцепление с цистеиновым остат-ком в позиции 347 Kx-протеина [333], формируя таким образом Kell-иммуноген полной длины. В то же время антитела к Kell-протеину удалось получить имму-низацией кроликов коротким пептидом, состоящим из 30 аминокислот, который был синтезирован с помощью кДНК клеток костного мозга человека.