Методов выявления антител

Как указывают многие исследователи, вновь создаваемые методы определе-ния антител должны быть по уровню чувствительности не ниже классической непрямой пробы Кумбса с использованием раствора низкой ионной силы (LISS) (Voak [679, 680], Bruce и соавт. [185], BCSH (Британский комитет по стандарти-зации в гематологии) [557], Poole и соавт. [533]).

Weisbach и соавт. [701] сравнили результаты определения антиэритроцитар-ных антител с помощью микрокапиллярных колонок и непрямой пробы Кумбса

У нашли, что чувствительность микрокапиллярного метода в отношении кли-нически значимых антител несколько выше, чем непрямой реакции Кумбса. Однако авторы не могли выявить анти-Jk а-антитела обоими сравниваемыми ме-тодами в 4 из 12 случаев.

Уместно подчеркнуть, что определение антител с помощью микрокапилляр-ных колонок включало инкубацию реагирующей смеси в течение 15 мин, а в не-прямой реакции Кумбса инкубация составляла 10 мин, что весьма существенно.

Fitzsimmons и Morel [287] установили, что увеличение времени инкубации реагирующей смеси повышает чувствительность непрямой реакции Кумбса. Дополнительные 5 мин инкубации могут быть решающими в выявлении бо-лее слабых антител.

Voak и соавт. [682] также привели данные о том, что продолжительность ин-кубации важна для выявления некоторых образцов слабых антител анти-Jk а, анти-Fy b и анти-K при использовании 1,5–2 % суспензии эритроцитов в раство-ре низкой ионной силы.

Bromilow и соавт. [183], Kretschmer и соавт. [399] считают, что тесты на ми-

крокапиллярных колонках Dia Med (Швейцария) чувствительнее, но Voak и соавт. [681], Phillips и соавт. [524], Pinkerton и соавт. [527] отмечают, что этот тест не бо-

лее чувствителен, чем хорошо выполненная непрямая проба Кумбса с LISS.

На наш взгляд, возможные причины того, что методы, основанные на ис-пользовании микрокапиллярных колонок, дают лучшие результаты, чем непря-мая проба Кумбса с LISS, могут заключаться, в следующем:

––микрокапиллярные гелевые технологии включают центрифугирование реагирующих ингредиентов непосредственно во время реакции, что су-щественно усиливает агглютинацию эритроцитов. Центрифугирование при выполнении непрямой пробы Кумбса используют только для отмыва-ния эритроцитов и это никак не сказывается на выраженности агглютина-ции. В то же время, если использовать центрифугирование на стадии вза-имодействия сенсибилизированных эритроцитов с антиглобулиновой сы-вороткой, то выраженность реакции можно существенно усилить;

300

––гелевые технологии имеют объективную, независимую от оператора, автоматизированную систему учета результатов, в то время как проби-рочные тесты, в том числе непрямая проба Кумбса с LISS, оценивают субъективно, и результат во многом зависит от навыков оператора.

Имеются указания на то, что чрезмерное встряхивание реагирующей сме-си может искажать результаты. Исследования, проведенные в рамках совмест-ной программы «Международного комитета стандартов в гематологии» и «Международного общества переливания крови» показали, что чрезмерное встряхивание при ресуспендировании взвеси эритроцитов является причиной ложноотрицательных результатов (Holburn [352], Voak и соавт. [684]).

Причиной искажения результатов может быть также недостаточное отмыва-ние эритроцитов (Voak и соавт. [683]).

1981 г. Voak и соавт. [684] провели серию экспериментов для изучения проблем, связанных с отмыванием эритроцитов при постановке непрямой ан-тиглобулиновой реакции. Авторы исследовали эритроциты, сенсибилизиро-ванные слабыми анти-D-антителами IgG, реагирующими с авидностью от + до ++. Для отмывания эритроцитов применяли разные солевые растворы и различные режимы центрифугирования. Установлено, что даже при использо-вании хорошо зарекомендовавших себя отмывающих растворов регистрируют ложные результаты.

Применение слепого метода для оценки работы персонала подтвердило, что примерно 20 % кадровых сотрудников ошибались в 5 % случаев при использо-вании эритроцитов, сенсибилизированных анти-D-антителами IgG, которые ре-агировали, как указывалось выше, с авидностью от + до ++ (Voak и соавт. [683]).

Причиной ошибочных результатов при выполнении непрямой реакции Кумбса может служить примесь антикомплементарных антител в поликлональ-ных тестовых антиглобулиновых сыворотках. Чаще всего встречаются антитела

У С3-компоненту комплемента. При инкубации свежей сыворотки, смешанной с эритроцитами, на последних может адсорбироваться комплемент, что создает видимость положительного результата.

Проблема специфичности поликлональных антиглобулиновых сывороток была в значительной мере решена, когда Международный комитет стандартов в гематологии [370] утвердил стандартные процедуры, необходимые для контро-ля примеси анти-С3d-антител в этих тестовых реагентах.

С целью предупреждения ошибок при учете результатов непрямой ре-акции Кумбса в программу обучения специалистов службы крови Англии включен слепой тест на выявление слабых антител, позволяющий проводить быстрое обучение и коррекцию любых ошибок, сопровождающих скрининг антител. Этот тест может быть использован для оценки результатов рабо-ты каждого работника. С 1987 г. он рекомендован Британским комитетом по стандартам в гематологии для специалистов-иммуносерологов госпиталь-ных банков крови [325].

301

В 1993 г. в Англии введен национальный референтный реагент анти-D IgG для контроля методов и мастерства операторов в отношении слабой, выявляе-мой нередко только под микроскопом агглютинации (Phillips и соавт. [523]).

Важным этапом в стандартизации методов выявления антиэритроцитарных антител и повышения их чувствительности явилось использование автоматиче-ских ридеров для плат (Poole и соавт. [533]), а также разработка гелевых мето-

дов DiaMed (Швейцария), Auto Bio Vue (Англия), Scan Gel (Франция, США).

Гелевые методы весьма перспективны. По оценкам специалистов, набор обо-рудования для гелевого метода может заменить 3-4 работников, что в экономи-чески развитых странах покрывает расходы достаточно быстро. Однако исполь-зование такого оборудования, стоимостью 150–160 тыс. долларов США, в оте-чественной службе крови представляется в настоящее время нерентабельным, поскольку в сравнении с отечественными методами определения групповой и резус-принадлежности крови оно на порядок дороже. Кроме того, иммуносеро-логам хорошо известно, что ни одна из автоматизированных систем не может выявить все существующие антитела в их многообразии.

Например, Cummins и соавт. [240] нашли, что гелевые методы DiaMed, Auto Bio Vue в ряде случаев не выявляют слабую несовместимость по системе АВО, которую выявляет простая пробирочная проба. Гелевые тесты в ряде случаев не выявляют слабые антитела анти-Fy a, анти-Jk a, анти-S, анти-K (Voak и соавт. [681], Phillips и соавт. [522, 524]).

Причиной этого является все то же центрифугирование, которое разрыва-ет слабые агглютинаты в процессе принудительного продавливания их через плотный гель. При исследовании 100 образцов плазмы группы В(III) с эрит­ роцитами А₂В(IV) гелевым тестом DiaMed не выявлено 68 случаев несов­ местимости, тестом Auto Bio Vue – 76 случаев, а 5-минутный пробирочный тест

с 0,9 % NaCl –8 случаев (Phillips и соавт. [522]).

Важным компонентом при определении антител наряду с методикой являют-ся используемые стандартные эритроциты. Результативность скрининга во мно-гом зависит от качества эритроцитов, присутствия в них тех или иных антигенов.

Какие эритроциты рекомендуется использовать для скрининга антител? В ответе на этот вопрос нет единого мнения. Для повседневного скрининга ан-тител используют одно-, двух- и трехклеточные панели стандартных эритроци-тов, содержащие максимальное количество трансфузионно опасных антигенов: D, С, Е, c, e, K, k, Fy a, Jk a, M, N, S, s, Le a, Lu a и др.

Для идентификации антиэритроцитарных антител используют многоклеточные панели, включающие C W и Kp a (Penny) и др., в том числе редкие антигены в гомо-

и гетерозиготном варианте. Такие панели требуют лаборатории с большим набором реагентов, хранилищем жидкого азота (Voak и Scott [685]). Некоторые исследователи полагают, что в высокочувствительных методах (СканГель, DiaMed и др.) можно ис-пользовать пулированные эритроциты, полученные смешиванием нескольких гомо-зиготных образцов. Так, Lillevang и соавт. [442] считают, что смесь из двух образцов

302

эритроцитов не менее надежна в серологических реакциях, чем те же образцы эри-троцитов, взятые раздельно. Смесь должна содержать эритроциты двух доноров, каждый из которых гомозиготен по разным трансфузионно опасным антигенам.

Eggington и соавт. [270] считают, что применение пулов эритроцитов снижа-ет чувствительность метода, затрудняет интерпретацию результатов, уменьшает процент выявления антител. К такому же выводу пришли Bombail-Girard и со-авт. [177], Phillips и Voak [521].

Возможность создания принципиально отличающейся системы, не связан-ной с прямым выявлением агглютинации эритроцитов, обсуждается в работе Narayanan и соавт. [503]. Авторы предложили новый способ учета реакции аг-глютинации в обычном и ультрафиолетовом свете. Эта система получила поло-жительную оценку Министерства здравоохранения США (Poole и соавт. [533]).

Метод дает возможность объективно оценить результаты непрямой реакции Кумбса, однако ряд технических особенностей не позволяет использовать его в конвейерной работе.

Предложены 6 приемов оценки иммуносерологических методов (Voak [679], Poole и соавт. [533]).

1. Тест на чувствительность, при котором применяют заведомо слабые анти-тела. Применение сильных антител сглаживает картину, так как они имеют вы-сокую авидность, поэтому их легко обнаруживают даже в больших разведениях.

2. Тест на воспроизводимость метода с использованием гетерозиготных образцов эритроцитов, сенсибилизированных слабыми референтным анти-D-антителами­ IgG.

3. Титрование антител, относящихся к разным антигенным системам эритро-цитов: анти-K, анти-Fy a, анти-Jk a и др. – для установления уровня чувствитель-ности в отношении антигенов каждой системы.

4. Пробный подбор совместимых пар донор – реципиент с применением све-жих образцов сыворотки и эритроцитов. Такой подбор позволяет выявить лож-ноположительные результаты, обусловленные комплементом исследуемой сы-воротки и антикомплементарными антителами, в основном анти-C3d, присут-ствующими в тестовых антиглобулиновых реагентах.

5. Сравнительные испытания (не менее 3000 тестов) в разных лечебных учреждениях. Такие испытания хорошо выявляют недостатки и слабости лю-бых тестовых систем, обладающих разной степенью чувствительности к тем или иным антигенам и антителам.

6. Тесты с гомо- и гетерозиготной формой различных антигенов для отобра методики, которая будет хорошо работать с гетерозиготными эритроцитами.

Например, микроплатовые системы Solid Screen (Biotest) и Capture (Immuno)

не требуют использования эритроцитов, гомозиготных по данным антигенам, и лучше выявляют слабые антитела, чем системы микрокапиллярных гелевых ко-лонок или классическая непрямая проба Кумбса (Poole и соавт. [533]).

Однако дальнейшие исследования показали, что примерно 50 % образцов эритроцитов Kk низкоавидны при выявлении антител Келл-Челлано. Это дает

303

основание беспокоиться о качестве скрининга антител, так как невозможно обе-спечить гомозиготными по антигену K эритроцитами все панели для скринин-га антител из-за относительной редкости гомозигот KK: 2–3 образца на 1 тыс. (Phillips, Voak [521]).

В литературе имеются сведения о создании иммуносерологических методов нового поколения, основанных на использовании антигенов эритроцитов, выде-ленных в чистом виде. Возможно, самая лучшая система, которая будет разра-ботана в ближайшем обозримом будущем, позволит проводить скрининг анти-тел с помощью биологического микрочипа, на который нанесены все известные трансфузионно опасные антигены. Над созданием подобных методов работает несколько групп ученых: одна - под руководством M. Scott в Международной референс-лаборатории групп крови (Бристоль, Англия), другая - под руковод-ством M. Read в Центре крови Нью-Йорка. Не исключено, что уже в ближай-шие годы мы можем стать свидетелями новых автоматизированных иммуно-ферментных методов определения клинически наиболее значимых эритроци-тарных антител без использования эритроцитов (Ekins [271], Ekins, Chu [272]). Попытки создания биочипов предпринимаются и в нашей стране.

Проанализированные нами данные литературы убеждают в том, что, несмо-тря на большой выбор автоматизированных методик, наилучшей до настоящего времени остается непрямая проба Кумбса.

По нашему мнению, упомянутое выше малогабаритное оборудова-ние Н.И. Васильева, специально предназначенное для проведения этой пробы, позволяет обеспечить высокое качество подбора совместимой крови для пере-ливания реципиенту.