Применяют микроскопический, бактериологический (основной), биологический, серологический методы, кожные аллергические про­бы, ПЦР. Исследуемые материалы многообразны и зависят от локализа­ции туберкулезных поражений, а именно: мокрота, бронхо-легочные аспираты, плевральная жидкость, ликвор, моча, костный мозг, гной, кровь и др. В данном пособии лабораторная диагностика разбирается на при­мере исследования мокроты.

А. Микроскопическое исследование является предварительным, так как не дает возможности надежно дифференцировать возбудите­лей туберкулеза от других микобактерии. Существует несколько вари­антов микроскопического исследования.

 Прямая микроскопия исследуемого материала. Готовят маз­ки, растирая гнойный комочек мокроты между предметными стеклами, и окрашивают их по способу Циля-Нильсена. При микроскопии хорошо видны рубиново-красные кислотоустой­чивые микобактерии на общем голубом фоне мокроты, некис­лотоустойчивые бактерии и форменные элементы имеют синий цвет. Для положительного заключения необходимо просмотреть 100 полей зрения, указав количество обнаруженных в них кис­лотоустойчивых бактерий. Прямая микроскопия - это сравни­тельно малочувствительный метод, позволяющий обнаружить микобактерии при их содержании в мокроте не менее 100000 клеток/мл.

Микроскопия предварительно обогащенного материала (не­прямая микроскопия). Методы обогащения основаны на прин­ципе извлечения микобактерии из мокроты и их концентрации в малом объеме; используют методы гомогенизации и флотации.

а) Гомогенизация. В банку с мокротой, собранной в течение суток, добавляют 1 % NaOH и энергично встряхивают в шюттель-аппарате. Гомогенизированную мокроту центрифугируют при 3000 об/мин, осадок нейтрализуют, добавив 1 -2 капли 10% НС1. Мазки из осадка окрашивают по Цилю-Нильсену.

б) Флотация. Гомогенизированную мокроту помещают в колбу, добавляют 1-2 мл ксилола (или бензола) и встряхивают в течение 10 минут, доливают дистиллированную воду до горлышка колбы и дают отстояться. В горлышке колбы образуется сливкообразный слой, состоящий из всплывших мельчайших капелек ксилола с сорбированными на них микобактериями. Из этого слоя готовят мазки на предметном стекле путем повторного наслаивания и окрашивают их по Цилю-Нильсену.

Методы обогащения повышают вероятность обнаружения мико­бактерии на 10%.

Люминесцентная микроскопия. Основана на способности липидов микобактерии поглощать люминесцентные красители и светиться в люминесцентном микроскопе. Мазки, приготовленные из осадка гомогенизированной мокроты (или флотационные мазки), окрашивают водным раствором флюорес­центных красителей - ауромин + родамин С - и микроскопируют в люминесцентном микроскопе с объективом х40. Туберкулезные ми­кобактерии светятся золотисто-желтым светом на темно-зеленом фоне, нетуберкулезные микобактерии дают зеленое свечение. Люминесцентная микроскопия повышает вероятность выявления микобактерии на 17%, т.е. наиболее чувствительна из микроскопичес­ких методов.

Б. Микрокультивирование - метод Прайса. Ускоренный ме­тод, сочетающий микроскопическое исследование с элементами бак­териологического метода (предварительное микрокультивирование). Дает возможность выявить туберкулезные микобактерии при их ма­лом содержании, а также наличие у них корд-фактора и тем самым доказать их вирулентность.

Готовят мазки из осадка (центрифугата) гомогенизированной мокроты или флотационного слоя, выдерживают их 15 минут в 2% H2S04 для уничтожения посторонней микрофлоры, промывают сте­рильной дистиллированной водой. Несколько стекол с мазками поме­щают в широкую пробирку с жидкой синтетической питательной средой (или разведенной цитратной кровью) и инкубируют при 37°С. Через каждые 3-5 дней, последовательно, вынимают по одному мазку и окрашивают способом Циля-Нильсена. Обычно через 6-10 дней на стеклах наблюдается рост микроколоний, выявляемых при микроско­пии.

Вирулентные туберкулезные микобактерии, содержащие корд-фактор, образуют микроколонии из тесно склеенных между собой рубиново-красных палочек в виде изогнутых жгутов или кос. Микроколонии невирулентных туберкулезных микобактерии представ­ляют собой беспорядочные рыхлые скопления бактериальных клеток.

В. Бактериологическое исследование является основным ме­тодом, позволяющим получить чистую культуру возбудителя туберку­леза, идентифицировать ее и определить лекарственную устойчивость (степень ее чувствительности) к химиотерапевтическим противотубер­кулезным препаратам. Бактериологическим методом удается выделять микобактерий при их концентрации от 20-100 живых бактерий в 1 мл клинического материала. Основной недостаток - длительность иссле­дования.

Исследуемый материал подвергают предварительной обработке для концентрации микобактерий и уничтожения посторонней микро­флоры. Мокроту обрабатывают щелочью (2% NaCl) или кислотой (10% H2SO4, подвергая встряхиванию, центрифугируют. Полученный осадок нейтрализуют и засевают в несколько про­бирок с яичной средой Левенштейна-Йенсена. Используют и другие среды - яичную среду Финн-II, картофельно-глицериновую, жидкую среду Сетона. Засеянные пробирки плотно укупоривают во избежание высыхания и инкубируют при 37°С до 2-3 месяцев, еженедельно просматривая. Видимый рост появляется, на­чиная с 10-12-14 дней и позже.

Ниациновая проба - ценный тест, с помощью которого M.tuberculosis дифференцируют от M.bovis и нетуберкулезных мико­бактерий. Только M.tuberculosis способны синтезировать никотиновую кислоту (ниацин) при культивировании на яичных средах. Для выяв­ления ниацина к выросшей культуре добавляют растворы 10% циани­стого бромида и 4% анилина. В положительном случае появляется ярко-желтое окрашивание.

Кроме того, у чистой культуры изучают скорость роста, образо­вание пигмента (на свету или в темноте), способность к росту при 20-25°С и к росту на простых питательных средах, наличие каталазы и пероксидазной активности и некоторые другие биологические про­бы. Эти пробы позволяют дифференцировать возбудителей ту­беркулеза.

У выделенных культур туберкулезных микобактерий в обязатель­ном порядке определяют степень лекарственной устойчивости к про­тивотуберкулезным химиопрепаратам. Для этой цели культуру засевают в пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, в которые перед сверты­ванием были внесены различные концентрации химиопрепаратов. Окончательную оценку проводят после 3-х недель инкубации. Учиты­вают отсутствие роста или степень его интенсивности в присутствии различных концентраций химиопрепаратов. Полученные результаты используют для назначения рациональной химиотерапии.

Г. Биологический метод в настоящее время применяют редко в диагностике туберкулеза легких, чаще всего при диагностике тубер­кулеза почек. Материалом от больного заражают лабораторных жи­вотных (морских свинок, чувствительных к M.tuberculosis, кроликов, восприимчивых к M.bovis), Наблюдают за животными в течение 1-2 месяцев до их гибели. С 5-10 дня после заражения можно исследовать пунктат лимфатических узлов.

Д. Серологический метод проводят для выявления антител в сыворотках больных туберкулезом или микобактериозом, а также для обнаружения антигенов микобактерий в исследуемом материале. С этой целью используют различные серологические реакции, такие как РСК, РИГА, РИА, ИФА.

Е. Кожно-аллергическая проба (туберкулинодиагностика) вы­являет ГЗТ, развивающуюся у вакцинированных вакциной БЦЖ, ин­фицированных и больных туберкулезом. Осуществляется с помощью препаратов туберкулина, который вводят накожно или внутрикожно.

Проба Манту - внутрикожная проба - применяется как основной метод туберкулинодиагностики при массовых ежегодных об­следованиях. Ее назначение:

- отбор контингентов лиц для ревакцинации БЦЖ;

- перед первичной вакцинацией детей в возрасте 2 месяцев и более;

- для диагностики туберкулеза, в том числе для раннего выявле­ния начальных и локальных форм туберкулеза у детей и подростков;

- для определения инфицирования микобактериями туберкулеза.

При постановке пробы Манту туберкулин вводят на внутреннею поверхность предплечья строго внутрикожно. Учитывают реакцию через 72 часа. Гиперемия учитывается только в случае отсутствия ин­фильтрата.

Проба Манту считается отрицательной при наличии только уколочной реакции (0-1 мм), сомнительной при гиперемии без папулы или наличии папулы диаметром 2-4 мм; положительной - при папуле диаметром 5 мм и более.

Лечение и профилактика

Специфическая профилактика осуществляется вакциной БЦЖ (BCG - Bacille Calmette - Gtierm). Вакцина БЦЖ и БЦЖ-М (со сни­женной антигенной нагрузкой) содержит живые, ослабленные мико­бактерии вакцинного штамма БЦЖ-1, лиофильно высушенные в 1,5% натрия глютаминате. Вакцина была получена А.Кальметтом и М.Гереном из штамма M.bovis длительным пассированием (230 пе­ресевов в течение 13 лет) на картофельно-глицериновой среде с до­бавлением желчи (метод аттенуации). Штамм сохранил остаточную вирулентность.

Вакцинацию проводят всем новорожденным на 5-6 день в роддо­ме внутрикожно. Ревакцинацию проводят в 7 лет и далее с интервалом в 5 лет до 30 летнего возраста при отрицательных туберкулиновых пробах.

Лечение туберкулеза проводится химиопрепаратами (антибиоти­ками и синтетическими препаратами). Их подразделяют на препараты первого ряда (изониазид, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид, рифампицин и др.) и альтернативные (канамицин, циклосерин, ПАСК, этионамид и др.

Возбудители дифтерии

1. Классификация и таксономия

Дифтерия - острое инфекционное заболевание, характеризующее­ся фибринозным воспалением на месте входных ворот (чаще всего глот­ки) и тяжелой интоксикацией организма с преимущественным поражением сердца, почек и нервной системы.

Corynebacterium diphtheriae относится к домену Bacteria, типу Actinomycetеae, порядку Actinomycetales, классу Actinobacteria, семейству Corynebacteriaceae, отделу Firmicutes, роду Corynebacterium.

Нозологичекие формы

Различают 3 типа дифтерийных микробов:

- gravis (тяжелый);

- mitis (средний);

- intermedius (промежуточный).

3. Эпидемиология и пути передачи

Источником инфекции при дифтерии -  человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель); наибольшую эпидемическую опасность представляют больные лица. Реконвалесценты выделяют дифтерийную палочку в течение 15-20 сут. Основной путь передачи дифтерийной палочки — воздушно-капельный; также возможно заражение через предметы, используемые больным, и инфицированные пищевые продукты (обычно молоко).