Для обнаружения холерных вибрионов в содержимом кишечника используют антительный диагностикум, т.е. эритроциты, на которых предварительно адсорбируют соответствующе антитела. Реакцию ставят по обычной методике. При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов происходит агглютинация эритроцитов.
А. Возбудитель холеры относится к семейству Vibrionaceae, роду Vibrio, в составе которого уже более 30 видов. Род Vibrio включает следующие виды, имеющие медицинское значение: V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. anginolyticus, V. vulnificus, V. fluvialis, V. mimicus.
К роду Vibrio относятся грамотрицательные, не образующие спор и капсул палочки, изогнутые (1/4 окружности или витка спирали) или прямые, с одним полярно расположенным жгутиком, индофенолоксидазоположительные, образующие кислоту без газа из d-глюкозы путем гликолиза по схеме Эмбден-Мейергофа (до молочной кислоты), имеющие декарбоксилазы лизина и орнитина, лишенные аргининдигидролазы, разжижающие желатин, восстанавливающие нитраты в нитриты и не образующие сероводорода.
Вид V. cholerае разделяют на следующие 4 биовара: Vibrio cholerae O1 cholerae, V. cholerae eltor), V. cholerae O139 bengal, V. cholerae non O1 - включает все холероподобные вибрионы, не относящиеся к O1-серологической группе. Первые три относятся к двум серогруппам – O1 и O139. Последний биовар включает прежние биотипы V. proteus и V. albensis и представлен многими другими сероварами вибрионов, которые не агглютинируются O1- и O139-сыворотками, т. е. НАГ-вибрионами. По О-антигену холероподобные (НАГ-) вибрионы разделяются на несколько десятков серогрупп. Могут вызывать холероподобные диареи. Вибрионы этих серогрупп идентифицируют с помощью соответствующих О-сывороток.
Б. Характеристика холерных и холероподобных вибрионов
Табл.2. Дифференциальные признаки холерных и холероподобных вибрионов
| Признаки | Вибрионы | |
| холерные | холероподобные | |
| Форма | в виде запятой | в виде запятой |
| Подвижность | + | + |
| Биохимические группы по Хейбергу | I | I-VIII |
| Агглютинация холерной сывороткой серогрупп О1 или О139 | + | - |
| Лизис специфическим монофагом | + | - |
| Диастатическая активность (на крахмал) | + | - (+) |
| Устойчивость к хлору при экспозиции 30 минут | предельная доза 0,4 мг/л воды | предельная доза 0,5-2 мг/л воды |
В. Табл.3. Дифференциальные признаки биоваров холерных вибрионов (классического и Эль Тор)
| Признаки | Биотипы | |
| классический | Эль Тор | |
| Гемолиз эритроцитов барана | - (+) | + (-) |
| Агглютинация куриных эритроцитов | - (+) | + (-) |
| Рост на среде с полимиксином (50 ед/мл) | - | + |
| Лизис фагом С (IV группа Мукерджи) в рабочем разведении (10-3) | + | - |
| Лизис фагом Эль Тор 2 в рабочем разведении (10-1 - 10-2) | - | + |
| Реакция Фогес - Проскауэра | - | + |
Г. Табл.4. Дифференциальные признаки патогенных и непатогенных галофильных вибрионов
| Признак | Vibrio parahaemolyticus | Vibrio alginolyticus |
| Рост в отсутствие NaCl | - | - |
| Рост в присутствии 7% NaCl | + | + |
| Рост в присутствии 10% NaCl | - | + |
| Ферментация сахарозы | - | + |
| Реакция Фогес - Проскауэра | - | + |
| Феномен роения | - | + |
| Гемолиз на среде с 7% NaCl | + | - |
Д. Табл.5. Холерный вибрион представлен тремя сероварами:
| Серотипы | Антигенная формула | Агглютинация сыворотками | ||
| О | Огава | Инаба | ||
| Огава | AB | + | + | - |
| Инаба | AC | + | - | + |
| Гикошима | ABC | + | + | + |
Е. Табл. 6. Биохимическая характеристика вибрионов по Хейбергу, Смиту и Гуднеру
| Углеводы | Группы | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| Манноза | + | - | + | - | + | - | + | - |
| Арабиноза | - | - | + | + | - | - | + | + |
| Сахароза | + | + | + | + | - | - | - | - |
Ж. Определение холерогенности (энтеротоксигенности) V . cholerae
Косвенные признаки отсутствия холерогенности у вибриона:
1. Наличие гемолитической активности,
2. отсутствие больных холерой;
3. отрицательные пробы с холерными диагностическими фагами (ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5).
Прямые методы обнаружения холерогена:
1. стимуляция клеточной аденилатциклазы в культурах клеток;
2. биологические пробы (на крольчатах-сосунках или на лигированной петле тонкого кишечника кролика);
3. реакция пассивного иммунного гемолиза (холероген взаимодействует с ганглиозидом эритроцитов, добавление антитоксинов и комплемента приводит к гемолизу);
4. иммуноферментный метод;
5. иммунофлуоресцентный метод;
6. ПЦР для обнаружения гена токсигенности.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА
Бактериологический метод
З А Н Я Т И Е 11
Дата ______________
Тема: Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций (столбняк, ботулизм, газовая анаэробная инфекция)
План занятия:
1. Морфология анаэробных бактерий. Микроскопия препаратов-мазков из культур патогенных анаэробов.
2. Изучение особенностей роста культур анаэробов на различных питательных средах.
3. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций. Разбор методов диагностики столбняка и газовой гангрены. Посев исследуемого материала по способу Вейон-Виньяля, Фортнера, на среду Китта-Тароцци. Регистрация результатов посева материала, содержащего анаэробные микробы, макро- и микроскопия выросших культур.
4. Ускоренное обнаружение С. реrfringens. Демонстрация роста на среде Вильсон-Блера, среде Китта-Тароцци и на молочной среде.
5. Биологическая проба на мышах для обнаружения ботулинического токсина. Разбор методики.
6. Демонстрация иммунопрепаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.
Методические указания
1. Морфология анаэробных бактерий. Микроскопия препаратов-мазков из культур патогенных анаэробов
Готовые препараты-мазки из чистых культур патогенных анаэробов окрасить по Граму, промикроскопировать. Препараты зарисовать. Обратить внимание на характер расположения спор, отношение к окраске.
2. Изучение особенностей роста культур анаэробов на различных питательных средах
Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Китта-Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.
3. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций. Разбор методов диагностики столбняка и газовой гангрены. Посев исследуемого материала по способу Вейон-Виньяля, Фортнера, на среду Китта-Тароцци. Регистрация результатов посева материала, содержащего анаэробные микробы, макро- и микроскопия выросших культур.
Для выделения чистых культур анаэробов берется раневое отделяемое. Исследование начинается с предварительной микроскопии исходного материала. Для этого готовят мазки и окрашивают по Граму. Обратить внимание на наличие капсул. Препараты зарисовать.
Посев производится на регенерированную, то есть предварительно прогретую на кипящей водяное бане в течение 10-20 мин для освобождения от растворенного в ней кислорода, среду Китта-Тароцци. Пастеровской пипеткой взять каплю гноя и, наклонив пробирку со средой Китта-Тароцци, по верхней стенке осторожно ввести каплю гноя на дно пробирки так, чтобы не попал воздух.
Зарегистрировать результаты посева материала, содержащего анаэробные микроорганизмы. Приготовить препарат-мазок, окрасить по Граму и зарисовать.
4. Ускоренное обнаружение С. реrfringens. Демонстрация роста на среде Вильсон-Блера, среде Китта-Тароцци и на молочной среде
Посев раневого отделяемого на среду Вильсон-Блера. Среда Вильсон-Блера предварительно расплавляется и выдается студентам в пробирках. Перед посевом ее необходимо охладить до температуры 40-45°С. Раневое отделяемое предварительно развести в стерильном физиологическом растворе. Для этого каплю исследуемого материала внести в пробирку с физиологическим раствором. Затем после перемешивания из этой пробирки каплю внести в пробирку со средой Вильсон-Блера, тщательно перемешать путем вдувания и выдувания содержимого и быстро набрать среду в трубки Вейон-Виньяля. Трубки положить в горизонтальном положении и дать им остыть. Концы трубок закрыть ватой.
6. Демонстрация иммунопрепаратов, п рименяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций
Демонстрация препаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.
| Рис.1.Патогенные анаэробы Окраска по Граму | Рис.2. Анаэробы в раневом отделяемом Окраска по Граму | Рис.3. Выделенная культура анаэробов Окраска по Граму |
Контрольные вопросы
1. Каковы основные биологические свойства анаэробных бактерий?
2. Какова роль анаэробных бактерий в патологии человека?
3. Какие заболевания вызывают анаэробные бактерии?
4. Каков механизм заражения при газовой гангрене?
5. Что является средой обитания анаэробных бактерий в естественных условиях?
6. Какие возбудители чаще всего вызывают газовую гангрену?
7. Какие токсины образуют возбудители газовой гангрены и на что они действуют?
8. Каковы особенности патогенеза газовой гангрены?
9. Какие условия способствуют развитию газовой гангрены?
10. По каким основным признакам различаются между собой C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum?
11. Какие ускоренные методы применяются для обнаружения C. perfringens?
12. Какие микробиологические методы используются для диагностики анаэробных инфекций?
13. Каковы основные морфологические, культуральные и биохимические особенности возбудителя столбняка?
14. Какова природа токсина столбнячной палочки и на что он действует?
15. Чем отличается картина столбняка у человека и у мелких лабораторных животных?
16. Что является средой обитания для столбнячной палочки?
17. Чем объясняется высокая обсемененность почвы столбнячной палочкой в Краснодарском крае?
18. Каковы основные морфологические и биологические свойства возбудителя ботулизма?
19. Какова природа токсина палочки ботулизма? Какие типы токсина продуцирует возбудитель и что поражает токсин?
20. Какие условия способствуют размножению возбудителя ботулизма и накоплению токсина в пищевом продукте?
21. Какой материал берется для исследования при подозрении на ботулизм?
22. Какие методы применяются для обнаружения токсина возбудителя ботулизма и определения его типа?
23. Какие продукты чаще всего являются причиной отравления при ботулизме?
24. Как осуществляется специфическая профилактика и лечение ботулизма? Какие препараты применяются для этой цели?
25. Что представляет собой протоксин?
26. Какова природа и структура столбнячного токсина?
27. Как активируется столбнячный токсин?
28. Что поражает столбнячный токсин?
29. Каковы функции тяжелой и легкой цепей столбнячного токсина?
30. Как продвигается столбнячный токсин к ядрам двигательных нервов?
31. Каков защитный уровень антитоксина против столбнячного токсина?
32. Как осуществляется специфическое лечение и специфическая профилактика столбняка?
33. Как обеспечивается формирование коллективного иммунитета против столбняка и какие препараты применяют для этой цели?
34. Что такое прогенитарные токсические комплексы, образуемые палочкой ботулизма?
35. Какие структурные варианты прогенитарных токсических комплексов Вы знаете? Каков их состав?
36. Как происходит активация ботулинического токсина?
37. Какая разница между протеолитическими и непротеолитическими вариантами возбудителя ботулизма? Каким образом осуществляется у них активация токсина?
38. В чем заключается механизм активации ботулинического токсина?
39. Какие функции выполняют нетоксические белки в составе белковых комплексов?
40. Каковы физико-химические свойства токсина ботулизма? Какие токсины, кроме нейротоксина, образует возбудитель ботулизма?
41. Ботулизм - интоксикация или токсикоинфекция? Что поражает ботулинический токсин?
42. Какой синдром чаще всего наблюдается у больных ботулизмом?
ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ 11
Ускоренный метод диагностики возбудителейгазовой гангрены по способу Комковой
Исследуемый материал вносят в 10 пробирок с полужидкой средой и затем 5 пробирок прогревают при 80ºC 20 минут. После этого в каждую пробирку добавляют различные моновалентные противогангренозные сыворотки.
Обнаружение через 10-18 часов микробов стрептобациллярной формы и роста их изолированными колониями подтверждает соответствие возбудителя типу сыворотки. Диффузный рост и беспорядочное расположение бацилл указывает на несоответствие возбудителя типу сыворотки.
МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БОТУЛИЗМА
А. Бактериологический (по классической схеме с последующей биологической пробой – см. ниже).
МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ГАЗОВОЙ ГАНГРЕНЫ
Бактериологический
Исследование проб на наличие патогенных клостридий.
Исследуемый материал.
| Посев на среды: | Посев по 1 мл в жидкие питательные среды - мясные или казеиновые (5 пробирок): 1-я пробирка - непрогретая, 2-я - прогрев при 80°C - 15 минут, 3-я - прогрев при 100ºC - 5 минут, 4-я - прогрев при 100ºC - 10 минут, 5-я - прогрев при 100ºC - 20 минут. Инкубация при 37ºC 1-15 суток. | ||||
| в чашках | в пробирке | ||||
| Кровяной МПА | Среда Виллиса-Хоббс | Среда Вильсон-Блера | |||
| Анаэробные условия | |||||
| Инкубация при 37ºС 1-7 суток | |||||
| Микроскопия, изоляция и пересев на мясную или казеиновую среду колоний, вызывающих гемолиз, опалесценцию или почернение на одной из указанных выше сред и состоящих из грамположительных палочек. | Выросшие культуры, содержащие массу грамположительных палочек, подвергают дальнейшему изучению. | ||||
| Изучение свойств выделенных культур. | Проверка токсичности фильтратов или центрифугатов на мышах или морских свинках. | Посев на плотные питательные среды: чашки с кровяным МПА, со средой Виллиса-Хоббс, с бензидиновым МПА, столбик агара Вильсон-Блера. | |||
| Реакция нейтрализации с сыворотками: C. perfringens типа А, С. novyi типа А, В, C. septicum, C. sordellii, C.histolyticum. | Инкубация при 37°C 1-4 суток. Изоляция колоний, вызывающих гемолиз, опалесценцию или почернение на питательных средах. Изучение свойств выделенных культур. | ||||
Б. Биологический
Дата: 2019-03-05, просмотров: 275.
