В третью группу входят:
· протеолиты;
· аммонификаторы и нитрификаторы;
· аэромоносы и бделловибрионы;
· споровые микроорганизмы;
· грибы и актиномицеты;
· целлюлозобактерии.
3. Санитарно-бактериологическое исследование воды питьевой:
Разбор нормируемых микробиологических показателей качества воды: общее микробное число (ОМЧ), общие колиформные бактерии (ОКБ), термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ), коли-фаги.
а) Определение ОМЧ (разбор схемы).
Для определения ОМЧ воды чаще всего используют метод 10-кратных разведений, когда концентрация микроорганизмов каждого последующего разведения в 10 раз меньше предыдущего, затем разведения высевают на питательные среды. В пустые стерильные чашки Петри, соблюдая правила асептики, стерильной пипеткой вносят 1 см3 из заранее приготовленного разведения. Чашки предварительно маркируют (со стороны донышка, а не крышки!), чтобы исключить случайную замену их при падении, сдвиге и др.
Разведения выбирают с таким расчётом, чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. Из каждой пробы засевают два разведения. Не позднее чем через 15 мин после внесения материала (разведения) в чашку наливают расплавленного и остуженного до 45+ 5°С 10-12 см3 питательного агара (питательную среду), толщина слоя которого должна быть 4-5 мм. Расплавленную среду и посевной материал незамедлительно тщательно перемешивают круговыми движениями, чтобы микроорганизмы равномерно распределились в массе среды. Чашки Петри оставляют на холодной горизонтальной поверхности на 10-15 мин для охлаждения и застывания среды, после чего посевы помещают в термостат и инкубируют при заданной температуре и экспозиции.
Для дальнейшей работы выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, а при посеве нативного материала - от 1 до 300 колоний. Количество колоний на поверхности и в глубине агара подсчитывают визуально или при помощи лупы с 2-5-кратным увеличением.
б) Определение ОКБ и ТКБ титрационным методом.
Метод основан на накоплении бактерий после посева определенных объемов воды в жидкие питательные среды, с последующим пересевом на дифференциальную плотную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам. При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор) засевают три объема по 100 см3. При исследовании воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ (повторный анализ) засевают соответственно 100, 10 и 1см3 — по три объема каждой серии.
в) Определение ОКБ и ТКБ методом мембранных фильтров.
Метод основан на фильтровании определенных объемов воды через мембранные фильтры. Для этих целей используют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм в диаметре (отечественные фильтры «Владипор» МФАС–С–1, МФАС–С–2, МФАС–МА (№ 4–6) или зарубежные — ISO 9000 или EN 29000). При исследовании воды неизвестного качества для получения изолированных колоний фильтруют следующие объёмы воды: 10, 40, 100 и 150 см3 соответственно на 4 фильтра. Далее фильтры помещают на чашки со средой Эндо и инкубируют при 37°С или 44°С в течение 24 ч. Если на фильтрах нет роста колоний или отмечен рост плёнчатых, губчатых, плесневых, прозрачных или расплывчатых колоний, то выдаётся отрицательный ответ.
4. Отсутствие «двойников», с которыми СПМО можно перепутать
Для санитарно-бактериологической оценки состояния воздуха используют седиментационный и аспирационный методы.
а) Седиментационный метод Коха прост, не требует специальной аппаратуры. Суть метода: чашка с питательной средой ставится на рабочем столе, открывается на 10 мин, закрывается и ставится в термостат, где выдерживается двое суток при температуре 37°С, а затем двое суток при комнатной температуре. После этого проводится подсчет выросших колоний по формуле Омелянского.
Для выявления грибов в воздухе посев проводится на среду Сабуро, и чашка выдерживается при 22-25°С до 5 суток. Для выявления патогенных бактерий посевы проводят на дифференциально-диагностические среды: для золотистого стафилококка — на желточно-солевой агар, для энтеробактерий — на среду Эндо с добавлением генцианвиолетта (для торможения роста сапрофитов), для псевдомонад — на среду № 9 (ГФ XI, т. 2). Чашки выдерживают в открытом виде 1 час, после чего ставят в термостат для культивирования при 37°С на двое суток с последующим выдерживанием при комнатной температуре в течение 2 суток.
Расчет по модифицированной формуле Омелянского ведется на 1 м2 поверхности:
X = n.104 / p.r2.t ,
где X - ОМЧ воздуха обследуемого помещения (КОЕ); п - количество колоний на чашке (КОЕ); t - время экспозиции чашки (мин); pr2 - площадь чашки Петри (см2); 104 - пересчет м2 в см2.
Формула Омелянского, даже модифицированная, имеет ряд существенных недостатков: 1) нельзя определить точный объем воздуха, из которого микробы оседают на чашку; 2) мелкодисперсная фаза аэрозоля (а с ним и микробы) практически не оседает и токами воздуха постоянно поддерживается во взвешенном состоянии.
Результаты, получаемые с помощью этого метода, позволяют сравнить, сопоставить степень микробной обсемененности разных помещений и ориентироваться при разработке мероприятий по очищению воздушной среды.
б) Аспирационный метод изучения микрофлоры воздуха основан на использовании ударной струи воздуха, получаемый с помощью аппарата Кротова или других подобных ему аппаратов (импактеры (ПУ-1Б), импинджеры (ПОВ-1), система HiAir PetriTM . Последняя позволяет пропускать до 1000 л воздуха за 200 сек.). Достоинства этого метода:
- точно учитывается объем воздуха, пропускаемого через чашку с питательной средой, установленную в аппарате;
- принцип ударной струи воздуха способствует фиксации на влажной поверхности питательной среде всех взвешенных частиц аэрозоля.
Таким образом, удается фиксировать на поверхности плотной питательной среды максимальное количество микроорганизмов, обитающих в воздухе. Используя различные виды элективных и дифференциально-диагностических питательных сред, можно выявлять в воздухе все основные группы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
5. Санитарно-бактериологическое исследование почвы (разбор)
Для санитарно-бактериологической оценки состояния почвы используют определение общего количества бактерий, бактерий группы кишечной палочки, а также определение перфрингенс-титра и нитрифицирующих бактерий.
а) При определении общего количества бактерий в почве посев проводят в 1,5% МПА – не менее двух различных разведений пробы в зависимости от степени предполагаемого загрязнения исследуемой почвы. Перед посевом каждое разведение тщательно перемешивают стерильной пипеткой, забирают 1 см3 суспензии и переносят на дно стерильной чашки Петри. Из каждого разведения посев проводят минимум в две параллельные чашки. После этого в чашки вливают 15-20 см3 предварительно расплавленного и остуженного до температуры 45 °С питательного агара, тщательно перемешивают с почвенной суспензией и оставляют до застывания в строго горизонтальном положении. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат в перевёрнутом виде (крышкой вниз) при температуре 37 °С на 24 ч. После инкубации подсчитывают выросшие колонии и проводят пересчёт на 1 г почвы.
б) Определение бактерий группы кишечных палочек проводят несколькими методами: бродильным (титрационным), методом мембранных фильтров и прямым поверхностным посевом в плотные питательные среды.
Бродильный (титрационный) метод. При анализе почвы с невысокой степенью фекального загрязнения рекомендуют проводить определение БГКП титрационным методом с использованием среды Кесслер или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида (ТТХ). 10 см3 почвенной суспензии первого разведения (1:10) засевают во флакон с 50 см3 среды, что соответствует посеву 1 г почвы. Последующие разведения высевают по 1 см3 в пробирки с 9 см3 той же среды. Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном добавляют 0,3 см3 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон – по 1,5 мл. Методика посева с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восстанавливать бесцветное соединение ТТХ в трифенилформазан, выпадающий в осадок, придающий среде коричнево-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микрофлоры подавляется. Посевы на среде Кесслер-Свенертона инкубируют 48 ч при температуре 43 или 37 °С. Отсутствие через 48 ч газообразования и помутнения в бродильных сосудах позволяет дать отрицательное заключение о наличии БГКП. Отрицательное заключение при использовании лактозного бульона с ТТХ дают через 24 ч в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился. При наличии признаков бактериального роста проводят высев на среду Эндо или розоловый агар. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °С 24 ч. В случае отсутствия признаков роста на чашках дают отрицательное заключение. Красные, розовые с металлическим блеском, жёлтые и оранжевые колонии на розоловой среде типичны для кишечных палочек. На заключительном этапе исследования проводят идентификацию выросших на агаризованных средах характерных колоний (аналогично анализу БГКП в воде). Результаты анализа выражают коли-титром.
Метод мембранных фильтров используют в качестве ускоренного метода анализа слабозагрязнённых почв. Через стерильные мембранные фильтры № 3 с помощью фильтровального аппарата Зейтца пропускают 5–10 см3 почвенной суспензии первого разведения, которую предварительно центрифугируют при 2000 об./мин в течение 5 мин. Дальнейшее исследование проводят аналогично анализу БГКП в воде методом мембранных фильтров.
Прямой поверхностный посев на плотные питательные среды применяют для исследования почвы из мест интенсивного фекального загрязнения. Проводят прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,05 см3 на среды Эндо. При анализе сравнительно чистых почв посев проводят из разведений 1:10-1:100, для загрязнённых почв используют разведение 1:106. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 24 ч. На следующем этапе исследования идентифицируют выделенные бактерии (аналогично определению БГКП в воде).
Результаты двух последних методов исследований выражают коли-титром или коли-индексом.
в) Определение перфрингенс-титра проводят по двум общепринятым методикам.
Посев почвенных разведений в среду Вильсона-Блера. Из всех почвенных разведений (до 1:106) образцы по 1 см3 переносят в 2 параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80 °С в течение 15 мин и/или при 90 °С – 10 мин. Затем во все пробирки добавляют по 9-10 см3 свежеприготовленной среды Вильсона-Блера. Инкубацию посевов проводят при температуре 37 или 43 °С в течение 24 ч. Учёт можно проводить и несколько раньше, так как санитарно-показательные клостридии, преимущественно С. perfringens , через несколько часов образуют колонии чёрного цвета. Обнаружение в мазках колоний характерных грамположительных палочек указывает на наличие С. perfringens . Общепринятая методика определения С. perfringens на среде Вильсона-Блера имеет существенный недостаток – питательная среда в определённой степени ингибирует рост микроорганизма. Для устранения этого явления предложена модификация методики.
Использование сред накопления для определения клостридий в почве. По 1 см3 прогретых и нативных почвенных разведений засевают в пробирки с полужидкими и жидкими питательными средами, предварительно регенерированными кипячением (Клодницкого, Китт-Тароцци, бульона Мартена с ватой и др.). После инкубации посевов в течение 18-20 ч при температуре 37°С проводят высев 0,5-1 см3 материала из помутневших пробирок в среду Вильсона-Блера или сульфит-полимиксин-неомициновую среду. Посев, инкубацию и учёт при этом проводят аналогично первому способу.
г) Для определения нитрифицирующих бактерий сеют почвенные разведения во флаконы с минеральной средой Виноградского, разлитой тонким слоем. В ходе эксперимента два флакона со средой оставляют незасеянными в качестве контроля чистоты среды. Посевы инкубируют при температуре 28°С в течение 14-15 сут. При развитии нитрифицирующих бактерий в среде образуются азотистая и азотная кислоты, которые определяют на 5-7 сутки после посева и вторично – на 14-15. Титр нитрифицирующих бактерий определяют качественной реакцией с дифениламином, который в присутствии азотистой и азотной кислот даёт синее окрашивание. Пастеровской пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносят на стеклянную или фарфоровую пластинку, добавляют несколько капель дефениламина, разведённого концентрированной серной кислоте. Синее окрашивание указывает на присутствие в среде продуктов метаболизма нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов должна оставаться без изменения окраски.
Контрольные вопросы
1. Какие микроорганизмы называют санитарно-показательными?
2. В чем сущность прямого метода санитарной оценки объектов внешней среды?
3. Какие существуют показатели-критерии косвенного метода индикации микроорганизмов внешней среды?
4. Что такое общее микробное число, и какие методы его определения вы знаете?
5. Какие микроорганизмы относятся к первой группе СПМО?
6. Какие бактерии называют колиформными?
7. Какие колонии образуют на среде Эндо типичные лактозоположительные бактерии?
8. Какие микроорганизмы относятся ко второй группе СПМО?
9. Что такое титр СПМО?
10. Что такое индекс СПМО?
11. Какие микробиологические показатели определяют при оценке качества питьевой воды централизованного водоснабжения?
12. Как определяют ОМЧ воды?
13. Что такое ОКБ и ТКБ?
14. В чем сущность метода мембранных фильтров при определении ОКБ и ТКБ воды?
15. Какие фильтры используют при исследовании воды?
16. Какие методы обнаружения микроорганизмов в воде вы знаете?
17. Как определяется ОКБ в почве?
18. Какие методы используются для определения БГКП в почве?
19. В чем сущность бродильного метода определения БГКП?
20. В каких случаях используется прямой поверхностный посев почвы на плотные питательные среды?
21. Что такое перфрингенс-титр, и какими методами он определяется?
22. Какие питательные среды используют для определения перфрингенс-титра?
23. Какие СПМО почвы вы знаете?
24. Какие показатели определяют при санитарном анализе почвы?
25. Какую роль в почве выполняют аммонификаторы и нитрификаторы?
26. Какие микробиологические показатели определяются при исследовании воздуха?
27. Что такое резидентная микрофлора воздуха?
28. Что такое транзиторная микрофлора воздуха?
29. Какие санитарно-показательные микроорганизмами при исследовании воздуха в закрытых помещениях вы знаете?
30. На каком принципе основан метод Коха при санитарно-микробиологическом исследовании воздуха?
31. Какие недостатки имеет метод Коха?
32. Как можно использовать результаты, полученные при исследовании воздуха методом Коха?
33. В чем сущность аспирационного метода изучения микрофлоры воздуха?
34. Какие приборы для отбора проб воздуха вы знаете?
35. Какие достоинства имеет аспирационный метод исследования воздуха?
36. Что такое общая бактериальная обсемененность воздуха?
ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ 13.
Т ump – минимальное количество субстрата (в кубических сантиметрах или граммах), в котором ещё обнаруживают СПМО.
Индекс – количество СПМО, которое содержится в 1 л воды или в 1см3 другого субстрата.
Общее микробное число и методы его определения
Общее микробное число (ОМЧ) – число всех микроорганизмов в 1 мл или в 1 г субстрата.
При этом учитывают, что чем больше микроорганизмов обнаружено во внешней среде, тем вероятнее загрязнение патогенными микроорганизмами. В связи с этим ОМЧ даёт представление об эпидемиологической обстановке.
Существуют три метода определения ОМЧ.
1. Оптический метод прямого подсчёта бактерий под микроскопом в камере Горяева.
2. Бактериологический метод (менее точный).
3. Измерение биомассы.
Оптический метод обычно используют на водопроводных станциях при оценке эффективности работы очистных сооружений, но он не позволяет отличить живые бактерии от мёртвых. Исследование можно выполнить в течение 1 ч, поэтому метод незаменим в аварийных ситуациях. Метод позволяет судить о состоянии процессов самоочищения воды. В начальной стадии процесса самоочищения грамотрицательных бактерий больше, чем грамположительных, а палочковидных форм больше, чем кокковых. На завершающей стадии соотношение меняется на обратное.
Бактериологическим методом выявляют определённую физиологическую группу бактерий, растущих при данных условиях. Например, обнаружение вегетативных форм микроорганизмов в прошедшем термическую обработку пищевом продукте свидетельствует о повторном заражении продукта после термической обработки или же о неэффективности последней. Обнаружение спор подтверждает удовлетворительное качество термической обработки.
Измерение биомассы осуществимо только в специализированных лабораториях путём взвешивания остатков бактериальной массы, определения показателей клеточного обмена и др. В практике этот метод не применяют.
ОМЧ определяют в следующих случаях:
· контроль качества очистки воды (в том числе колодезной);
· проверка эффективности мойки посуды;
· контроль чистоты воздуха в закрытых помещениях;
· определение свежести скоропортящихся продуктов;
· выбор места для строительства жилых объектов (исследование почвы);
· определение характера микрофлоры
Дата: 2019-03-05, просмотров: 207.