и полимеразная цепная реакция

и Саузерн-блот

Вторая, наиболее многочисленная, группа методов может быть подразделена на 3 подгруппы: конглютинационные, антиглобулиновые и ферментные.

в качестве самостоятельной группы следует выделить методы с использо-ванием специальных карточек с высушенными на них тестовыми реактивами. Перед исследованием высушенные реагенты растворяют каплями воды и прово-дят определение как на плоскости.

Отдельные группы составляют инструментальные методы – анализаторы групп крови, а также молекулярно-биологические технологии.

По оснащению и технике выполнения методы можно разделить на проби-рочные, капиллярные и выполняемые на плоскости.

в первые годы после открытия резус-фактора его определяли с помощью агглютинации в солевой среде, основанной на использовании сывороток, со-держащих полные антирезус-антитела. Этот метод был разработан в 1941 г.

290

Landsteiner и Wiener [408] и усовершенствован Boorman, Dodd и Mollison [179].

и СССР метод агглютинации в солевой среде был внедрен в Центральном ин-ституте переливания крови М.А. Умновой [113] и его применяют до настояще-го времени.

Метод отличается точностью и четкостью результатов, однако при его вы-полнении необходимо отмывать исследуемые эритроциты, готовить из них взвеси и длительно (1 ч) инкубировать взвеси с сывороткой. Перечисленные ма-нипуляции требуют специального оснащения: термостата, центрифуги, микро-пробирок, что усложняет исследование и увеличивает его продолжительность.

связи с этим усилия многих исследователей были направлены на упроще-ние этого метода. Однако многочисленные модификации метода солевой агглю-тинации, в частности капиллярные методики (Chown [215], Chown, Lewis [217, 220]), пробы с применением центрифугирования (Poole, Williams [534], Harvey [337], Majsky [455]) или выполняемые на плоскости (Wootton [723]), были по существу сведены к упрощению отдельных технических элементов. В целом же определение резус-фактора этим методом продолжает оставаться до настояще-го времени относительно сложным и продолжительным лабораторным исследо-ванием. К этому следует добавить и то обстоятельство, что сыворотки с полны-ми антителами, необходимые для метода агглютинации в солевой среде, редко встречаются и их количество ограничено. Однако с внедрением технологий по-лучения моноклональных антител это ограничение было снято.

Более перспективными оказались методы, включающие использование сы-вороток с неполными антителами. Благодаря относительной простоте и доступ-ности тестовых сывороток они нашли широкое применение как за рубежом, так и в России.

Наибольший практический интерес из этой группы методов представляют конглютинационные пробы, основанные на использовании различных коллоид-ных жидкостей, которые либо добавляют к тестовой сыворотке, либо взвешива-ют в них исследуемые эритроциты.

Первая конглютинационная проба с применением в качестве коллоидной среды плазмы крови была предложена Diamond и Abelson [262].

СССР аналогичный метод был разработан независимо от указанных выше авторов в Ленинградском институте переливания крови Н.И. Блиновым и Н.Д. Дробышевой [21] и впоследствии усовершенствован Т.Г. Соловьевой [104]. Этот метод, получивший название – определение резус-фактора в сывороточ-ной среде на чашках Петри, основан на использовании эритроцитов, взвешен-ных в собственной сыворотке. Взвесь эритроцитов и тестовых сывороток нано-сят на чашку Петри, которую затем помещают в водяную баню при температу-ре 45–48  оС. Результат учитывают после 10-минутной инкубации взвеси по на-личию или отсутствию агглютинации эритроцитов. «Чашечный» метод прост и удобен, однако его недостатком является невозможность исследования свежей цельной крови, так как в условиях указанной температуры она свертывается.

291

Для устранения этого недостатка Е.C. Копосов [67, 68] рекомендовал ис-пользовать смесь свежей цельной крови с одногруппной стандартной изогемаг-глютинирующей сывороткой.

А.Я. Ашкенази [13] предложила другой, более удачный, прием устранения отмеченного недостатка «чашечного» метода. Автор рекомендовала добавлять

В тестовую сыворотку гепарин, что позволило определять резус-фактор свежей крови, взятой непосредственно от обследуемого. Тем не менее «чашечный» ме-тод, так же как и другие конглютинационные пробы, основанные на использо-вании плазмы или сыворотки, нуждался в существенной доработке. Дело в том, что плазма и сыворотка, в которой взвешивают исследуемые эритроциты, об-ладают относительно низкой конглютинационной активностью, в силу чего аг-глютинация эритроцитов в большинстве случаев выражена недостаточно силь-но. Поиски коллоидных сред с более выраженными конглютинационными свой-ствами привели исследователей к использованию других естественных и синте-тических коллоидов.

Diamond и Denton [263] впервые отметили, что агглютинация эритроцитов выражена в значительно большой степени, если плазму, в которой они были взвешены, заменить раствором альбумина. Позднее эти данные были подтверж-дены, и альбумин стал широко применяться при определении резус-фактора

(Р.М. Уринсон [118], Tuck [663], Stratton [633], Lawrence [414]).

Fisk и Mc Gee [286] обратили внимание на высокие конглютинационные свойства раствора желатина и предложили использовать его в качестве кол-лоидной среды при определении резус-фактора и выявлении неполных резус-антител. Впоследствии этот метод был модифицирован А.Г. Башлай [15] и до настоящего времени с успехом применяется во многих серологических лабора-ториях Российской Федерации.

О.В. Успенская [123] привела данные, свидетельствующие о том, что приме-нение раствора желатины при определении резус-фактора позволяет сократить продолжительность этого исследования.

Grubb [324], изучая конглютинационные свойства синтетического плазмоза-менителя – декстрана, показал, что титры сывороток антирезус при разведении их декстраном значительно превышают результаты титрования в изотоническом растворе натрия хлорида.

Продолжая начатые Grubb исследования, Jones [382] и Bonnel [178] устано-вили, что декстран по сравнению с изогемагглютинирующими сыворотками и альбумином также обладает более выраженными конглютинационными свой-ствами.

И.И. Забалуева [54], изучив конглютинационные свойства декстрана, указа-ла на возможность его применения в качестве стандартного разводителя, позво-ляющего увеличить ресурсы дефицитных сывороток антирезус. Кроме того, ис-пользование декстрана при определении резус-фактора значительно повысило демонстративность реакции (А.Я. Ашкенази [9], О.В. Успенская [123]).

292

Наряду с перечисленными коллоидами широкое применение в серологиче-ских реакциях нашел также другой синтетический плазмозаменитель – поливи-нилпирролидон, который не уступает по своим конглютинационным свойствам растворам декстрана (McNeil, Trentelman [474], Stroje и соавт. [637]).

Замена плазмы другими коллоидными разводителями позволила существен-но улучшить качество конглютинационных методов, в частности повысить чет-кость результатов исследования, сократить его продолжительность.

Дальнейшее совершенствование конглютинационных проб способствовало созданию методов, пригодных для определения резус-фактора без нагреватель-ных приборов. Интересные данные получили Eldon [273] и Drachmann [264], Они показали, что сыворотки антирезус, разведенные высокомолекулярным декстраном, приобретают способность специфически агглютинировать эритро-циты в условиях комнатной температуры.

Вслед за этим были предложены методы определения резус-фактора без подогрева с использованием альбумина (Murray [499]; Hrubisko, Hrabinska [354]; Sturgeon [640]) и гепарина (А.Я. Ашкенази [13]; Daszynski [250]). Наи­ больший практический интерес представляет метод, разработанный Hrubisko и Hrabinska. При определении резус-фактора этим методом каплю тестовой сы-воротки в комбинации с альбумином наносят на предметное стекло и добавля-ют 5–10 % взвесь эритроцитов в собственной сыворотке. Стекло оставляют на 10 мин при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

Таким образом, применение коллоидных растворов с более выраженным, чем у плазмы, конглютинационными свойствами позволило не только сократить продолжительность определения резус-фактора и повысить четкость результа-тов этого исследования, но и существенно упростить его.

Нами совместно с Р.М. Уринсон и Е.А. Зотиковым [34, 49] был разработан экспресс-метод определения резус-фактора на плоскости без подогрева, осно-ванный на использовании сывороток антирезус в комбинации с альбумином или полиглюкином. Этот метод позволил определять одновременно резус-фактор, его разновидности и группу крови. Благодаря своей простоте и доступности он широко применялся в лечебно-профилактических учреждениях России в пери-од с 1966 г. до конца 1980-х гг., пока не уступил место еще более простым мето-дам с использованием моноклональных антител.

Также перспективным в плане разработки более совершенных методов опре-деления резус-фактора оказалось еще одно направление, а именно использова-ние в серологических реакциях протеолитических ферментов.

Первые сообщения о принципе ускорения реакции антиген – антитело с помо-щью ферментов появилось в 1946–1947 гг. (Pickles [525], Morton, Pickles [490]). Вскоре после этого различными авторами был предложен целый ряд серологиче-ских методов выявления антигенов и антител с использованием протеолитических ферментов животного, растительного и бактериального происхождения: трипсина (Morton, Pickles [489], Willert [718], Young [727]), папаина (Löv [449], Gilbey [303]),

293

бромелина (Pirofsky и соавт. [528], Moore и соавт. [479], Majsky [456]), протелина (Р.С. Сахаров [95]), фицина (С.И. Донсков [36]) и других ферментов.

Разработка этих методов имела большое практическое значение, так как по-зволила повысить чувствительность реакции. Более того, с помощью фермен-тов некоторым авторам удалось создать методы определения резус-фактора, не требующие нагревательных приборов (Р.С. Сахаров [95], С.И. Донсков [36]).

При определении резус-фактора методом, разработанным Hekker с соавт. [344], тестовую сыворотку, папаин, активированный солянокислым цистеином, и взвесь исследуемых эритроцитов наносят на предметное стекло и выдерживают

с течение 15 мин при комнатной температуре. После этого стекло покачивают и учитывают результат. Morganti [488] и Esche [274] дали высокую оценку этому методу, подчеркивая его быстроту и наглядность результатов. То же самое можно сказать о методе, предложенном Tribedi, Crosbie [662] и Р.С. Сахаровым [95].

Таким образом, была показана принципиальная возможность определения резус-фактора с помощью сывороток в сочетании с высокомолекулярными кол-лоидами или протеолитическими ферментами и созданы первые методы, такие же быстрые, удобные и простые как определение группы крови.