Поможем в ✍️ написании учебной работы

Имя

Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

Выберите тип работыЧасть дипломаДипломная работаКурсовая работаКонтрольная работаРешение задачРефератНаучно - исследовательская работаОтчет по практикеОтветы на билетыТест/экзамен onlineМонографияЭссеДокладКомпьютерный набор текстаКомпьютерный чертежРецензияПереводРепетиторБизнес-планКонспектыПроверка качестваЭкзамен на сайтеАспирантский рефератМагистерская работаНаучная статьяНаучный трудТехническая редакция текстаЧертеж от рукиДиаграммы, таблицыПрезентация к защитеТезисный планРечь к дипломуДоработка заказа клиентаОтзыв на дипломПубликация статьи в ВАКПубликация статьи в ScopusДипломная работа MBAПовышение оригинальностиКопирайтингДругое

Нажимая кнопку "Продолжить", я принимаю политику конфиденциальности

Cdk могут также ингибироваться фосфорилированием. Ингибиторное фосфорилирование вносит вклад в отсчет времени митоза. До митоза комплекс циклин В-cdc2 (Cdk1) инактивирован фосфорилированием по треонину-14 и тирозину-15. Фосфорилирование остатков у позвоночных осуществляется Myt1 и Wee1 соответственно. К концу G2 резкое дефосфорилирование этих двух остатков активирует cdc2 и запускает митоз. Дефосфорилирование осуществляется фосфатазами семейства CDC25. Во время митоза Myt1, Wee1 и CDC25 фосфорилированы. Это уменьшает активность Myt1, тогда как активность CDC25 увеличивается, что способствует активации cdc2. Интересно, что циклин В-cdc2 может непосредственно активировать CDC25. Такая прямая обратная связь и обеспечивает резкое дефосфорилирование. Кроме циклин В-cdc2 в фосфорилировании CDC25 принимают участие представители семейства Polo киназ (Polo like kinase 1 - Plk1 у млекопитающих).

Регуляция циклинов

Регуляция циклинов осуществляется на двух уровнях: транскрипции генов и деградации белка. Регуляция транскрипции генов циклинов у высших эукариот изучена на примере перехода ограничительной точки клеточного цикла. Центральную роль в этом переходе играет E2F, фактор транскрипции некоторых генов, необходимых для синтеза ДНК в S фазе. Он стимулирует также транскрипцию генов циклина А, циклина Е и своего собственного гена. Белок pRb ингибирует E2F, связываясь с последним в G1 фазе.      Факторы роста стимулируют транскрипцию циклина D через Ras-Raf-MAP сигнальный каскад или под действием цАМФ. Происходит накопление комплексов циклин D-Cdk4, которые начинают фосфорилировать Rb, что приводит к его диссоциации от E2F. Освободившийся E2F стимулирует транскрипцию своего гена и гена циклина Е. Образующийся вследствие этого комплекс CDK2-цЕ, еще активнее фосфорилирует pRb. Таким образом, сеть эффектов через петлю положительной обратной связи приводит к быстрому возрастанию E2F зависимой транскрипции и переходу клетки в начало S фазы. Вскоре после этого в клетке появляются комплексы Cdk2-цА, которые фосфорилируют E2F, уменьшая его способность связываться с ДНК.      Другим способом регуляции циклинов является их разрушение протеолизом. Таким образом контролируется, например, выход из митоза. Деструкция митотических циклинов необходима для начала телофазы и подготовки к следующему циклу. Возле N-конца митотические циклины А и В несут небольшую последовательность, называемую боксом деструкции. Эта последовательность необходима для конъюгации циклина с убиквитином, который является маркером для узнавания циклина протеазой. Большая часть цитозольного протеолиза осуществляется протеосомами. Протеосомы - это нелизосомальные мультикаталитические протеиназы, обнаруженные у эукариот, широко распространенные в цитоплазме. Они обладают 20S каталитическим ядром (М = 700 кд) которое осуществляет АТФ-зависимую деградацию убиквитинированных белков. 20S протеосома состоит из 14 субъединиц, представляющих собой различные протеазы. Они образуют бочкообразную структуру с активными центрами внутри. Большие протеазные комплексы, по крайней мере, из десяти различных полипептидов образуют дно и крышку такой бочки. Из роль, видимо, заключается в транспорте убиквитинированных белков в центр бочки. Ключевым регуляторным компонентом в деструкции митотических циклинов является мультисубъединичный комплекс APC (anaphase promoting complex) или циклосома. Этот комплекс осуществляет присоединение убиквитина к циклинам и другим субстратам. Комплекс имеет различную субстратную специфичность в переходе метафаза-анафаза и выходе из митоза, так как связан в эти периоды с двумя различными регуляторными белками - Сdc20 и Hct1 соответственно. Одним из субстратов ACP-Сdc20 является комплекс белков секурина и сепарина, который удерживает вместе сестринские хроматиды хромосомы. APC-Сdc20 способствует разрушению секурина, под действием освободившегося сепарина сестринские хроматиды расходятся, то есть осуществляется переход в анафазу. Комплекс APC-Hct1 осуществляет убиквитинирование циклина В. АСР активируется после длительного лаг-периода посредством циклин А-Cdk2 и инактивируется под действием G1 циклинов. Таким образом, молекулярные механизмы, которые запускают все события клеточного цикла, должны работать по принципу "все или ничего", действуя необратимо и постоянно. Клеточный цикл можно рассматривать как продукт программы резкого возрастания и падения активности Cdk. Активация одного циклин-киназного комплекса должна быть не только триггером событий клеточного цикла, но и должна инициировать активацию следующего циклин-киназного комплекса. Таким образом, запрограммированная последовательность передачи сигнала от одного комплекса к другому представляет собой часы клеточного цикла. Классическим примером автономного колебания активности Cdk является колебание активности комплекса циклин В-cdc2 (MPF) в раннем эмбрионе лягушки Xenopus. После деструкции комплекса циклин А-cdc2 и выхода из S фазы постоянный синтез циклина В приводит к его накоплению и, следовательно, образованию комплексов циклин В-cdc2. Первоначально эти комплексы неактивны, так как они ингибированы фосфорилированием по треонину-14 и тирозину-15 киназой Wee1. Однако по мере их накопления достигается порог концентрации, при котором они могут фосфорилировать CDC25 и Wee1, вызывая соответственно их активацию и ингибирование. Фосфорилированная CDC25 дефосфорилирует и активирует циклин-киназный комплекс. Положительная обратная связь этих двух процессов вызывает резкое возрастание киназной активности циклин В-cdc2. Повышенная киназная активность вызывает переход клетки к митотическому статусу через фосфорилирование различных клеточных субстратов. После слабо изученной лаг-фазы активированный циклин-киназный комплекс инициирует деградацию циклина под действием убиквитин-зависимого протеолиза. Разрушение циклина вызывает потерю киназной активности и выход из митоза.

 Глава 7. Механизмы запрограммированной

Клеточной гибели. Апоптоз

В настоящее время известно, что в основе механизмов трансформации клетки лежит изменение контроля пролиферации или апоптоза. Апоптоз - это генетически запрограммированный путь клеточной смерти, необходимый в развитии многоклеточного организма и участвующий в поддержании тканевого гомеостаза. Этот механизм, как известно, вызывается различными сигналами: связыванием с рецепторами специфических киллерных лигандов, нехваткой факторов роста/выживания, повреждениями ДНК и разрушениями цитоскелета, гипоксией и другими неблагоприятными условиями.

Морфология апоптоза.

С начала фенотипического описания апоптоза было замечено, что этот процесс встречается в большинстве, если не во всех, типах клеток организма. В основе этой гипотезы лежало морфологическое сходство в клетках различных тканей, вступающих на этот путь. Для таких клеток характерны изменения, среди которых одними из первых является сжатие клетки и потеря ею контактов с окружающими клетками и межклеточным матриксом. На ранних стадиях апоптоза плазматическая мембрана умирающей клетки остается интактной. Клетка посылает сигналы, и окружающие клетки узнают и фагоцитируют ее. Одним из таких сигналов является экспозиция на поверхности фосфатидилсерина. Это происходит до снижения митохондриального трансмембранного потенциала и высвобождения цитохрома С, об этих событиях будет сказано ниже. Для облегчения своего поглощения апоптотическая клетка уменьшает свой объем, выкачивая ионы (К , С1-, органические осмолиты), и сокращается, перестраивая цитоскелет. Кроме того, плазматическая мембрана клетки начинает образовывать пузырьки, что в отсутствие фагоцитоза приводит к формированию апоптозных телец, содержащих конденсированные или морфологически не измененные органеллы. Также сокращение клетки обычно сопровождается уплотнением ядерного содержимого. Происходит агрегация хроматина и фрагментация ядра. Было показано, что после индукции апоптоза расщепление ДНК начинается с образования высокомолекулярных фрагментов длиной 50-300 т.п.н, что близко по размеру длине ДНК в петлях хромосом. Затем эти фрагменты обычно распадаются до нуклеосом и их олигомеров.      Большинство из вышеперечисленных изменений можно легко заметить под микроскопом. Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах он обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз - в отличие от некроза - никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление. В табл. 9 приведены данные по сравнительной характеристике некроза и апоптоза Табл. 9. Сравнительная характеристика некроза и апоптоза

Признак	Апоптоз	Некроз
Распространенность	Одиночная клетка	Группа клеток
Индукция	Активируется физиологическими/или патологическими стимулами	Различная в зависимости от повреждающего фактора
Биохимические изменения	Энергозависимая фрагментация ДНК эндогенными эндонуклеазами Лизосомы интактные	Нарушение или прекращение ионного обмена. Из лизосом высвобождаются ферменты
Распад ДНК	Внутриядерная конденсация с расщеплением на фрагменты	Диффузная локализация в некротизированной клетке
Целостность клеточной мембраны	Сохранена	Нарушена
Морфология	Сморщивание клеток и фрагментация	Набухание и лизис клеток
Воспалительный ответ	Нет	Обычно есть
Удаление погибших клеток	Поглощение (фагоцитоз) соседними клетками	Поглощение (фагоцитоз) нейтрофилами и макрофагами

Апоптоз отличается от некроза по количеству вовлеченных в процесс клеток, по основным биохимическим и морфологическим показателям. При апоптозе сохраняется целостность плазматической мембраны и отсутствует воспалительный ответ. Изменение морфологических признаков более четко выявляют электронно-микроскопическим исследованием. Для клетки, подвергающейся апоптозу характерно: Сжатие клетки. Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нормальными, располагаются более компактно.      Предполагается, что нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы. Этот фермент вызывает прогрессивное образование перекрестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной оболочки под клеточной мембраной, подобно ороговевающим клеткам эпителия.      Конденсация хроматина. Это наиболее характерное проявление апоптоза. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Ядро же может разрываться на два или несколько фрагментов. Механизм конденсации хроматина изучен достаточно хорошо. Он обусловлен расщеплением ядерной ДНК в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к развитию большого количества фрагментов, в которых число пар оснований делится на 180-200. При электрофорезе фрагменты дают характерную картину лестницы. Эта картина отличается от таковой при некрозе клеток, где длина фрагментов ДНК варьирует. Фрагментация ДНК в нуклеосомах происходит под действием кальций чувствительной эндонуклеазы. Эндонуклеаза в некоторых клетках находится постоянно (например, в тимоцитах), где она активируется появлением в цитоплазме свободного кальция, а в других клетках синтезируется перед началом апоптоза. Однако еще не установлено, каким образом после расщепления ДНК эндонуклеазой происходит конденсация хроматина. Формирование апоптотических телец. В апоптотической клетке первоначально формируются глубокие впячивания поверхности с образованием полостей, что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с или без фрагментов ядра. Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками или макрофагами. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство. Фагоцитоз апоптотических телец макрофагами или другими клетками активируется рецепторами на этих клетках: Они захватывают и поглощают апоптотические клетки. Один из таких рецепторов на макрофагах - рецептор витронектина, который является ?3-интегрином и активирует фагоцитоз апоптотических нейтрофилов.