Многие типы рака возникают как результат множественных событий: активаций протоонкогенов (ПО) и инактиваций раковых супрессорных генов (РСГ). Так как нормальная клетка имеет множественные механизмы регуляции клеточного роста, необходимо несколько изменений для нарушения его контроля. Доказательством этого является обнаружение в раковых клетках генов с мутациями. На сегодняшний день найдены гены, мутация в которых строго вызывает предрасположенность к раку, то есть они предоставляют одно из необходимых событий канцерогенеза. Активация протоонкогенов с трансформационным потенциалом может не быть достаточной для появления рака, однако их изучение помогает понять природу этих событий. Редко образование раковой опухоли связано с активацией одного онкогена. Как правило, необходимо совместное действие нескольких генов. Так, например, среди трансгенных мышей несущих v-myc рак развивается лишь у 10% особей, среди трансгенных мышей несущих v-ras - у 40% особей, а у трансгенных мышей несущих оба активных гена – у всех особей. Среди протоонкогенов довольно часто встречаются белки, регулирующие клеточную дифференцировку. Остановка дифференцировки ведет к продолжению пролиферации, что дает большие возможности для появления мутаций в онкогенах. Во многих случаях существует строгая корреляция между активацией онкогенов и ростом опухоли, но природа инициирующего события остается неизвестной. Можно надеяться, что изучение клеточных онкогенов поможет ее понять. Основное свойство высших эукариот – определенное время жизни организма. Это свойство поддерживается в индивидуальных соматических клетках, чей рост и деление строго регулируемый процесс. Исключение из этого правила составляет рак, который возникает при потере контроля роста. При перерождении нормальной клетки в раковую может проявляться 3 типа изменений: 1. Увековечивание или иммортализация – свойство неопределенного роста без изменений в фенотипе клетки, связанное с изменениями в контроле роста, которые не описаны в терминах молекулярной биологии. 2. Трансформация – потеря контроля роста, например, трансформированная клетка становится независимой от факторов, которые ей обычно необходимы. Причины, которые вызывают трансформацию, довольно неплохо описаны молекулярными и клеточными терминами. 3. Метастазирование – поражение раковыми клетками нормальных тканей, появление новых колоний раковых клеток в различных частях тела. Молекулярные события, вовлеченные в метастазирование, такие как секреция протеаз, только сейчас начинают описываться в терминах молекулярной биологии. Чтобы охарактеризовать абберантные события, которые приводят к потере контроля роста и возникновению опухоли, нужно сравнить характеристики роста нормальных и трансформированных клеток in vitro. Трансформированные клетки в культуре могут расти постоянно, тогда как для нормальной клетки это практически не возможно. В культуре клетки растут около 50 делений (число Хейфлика), затем наступает кризис, когда большинство клеток погибает. Выживают лишь иммортализованные клетки, то есть клетки, способные делиться неопределенно, но их свойства изменились в результате кризиса. Природа этого явления остается непонятной, в частности, природа молекулярных изменений, которые адаптируют клетку к росту в культуре. Ограниченность времени жизни клеток кризисом ставит нас перед двумя направлениями для изучения нетрансформированных клеток. 1. Первичные клетки, взятые сразу в культуру, которые имитируют жизнь in vivo до кризиса. 2. Клетки, которые прошли через кризис и достигли формирования клеточной культуры (нераковые клетки). Их свойства изменены и будут изменяться во время адаптации к культуре. Эти изменения могут частично напоминать образование опухоли. Сформировавшиеся последним образом клетки по определению становятся иммортализованными, но не раковыми. Такие линии остаются под клеточным контролем. Их свойства близки к первичной культуре, то есть: - им необходим носитель, с которым они соприкасаются - необходимо наличие факторов роста в среде - плотность расположения клеток контролируется межклеточными контактами - клетки растут монослоем и разветвлены При росте клеток в культуре существует лишь приближение к условиям in vivo. Изучая факторы роста на таких линиях, нужно помнить, что в культурах есть изменения в комплементарности хромосом, то есть клетки, как правило, не диплоидные, а анеуплоидные. Трансформированные клетки растут в не столь строгой манере: им не нужен твердый носитель, вместо монослойного расположения они складываются в тонкую массу клеток, называемую фокусом. И, наконец, они способны индуцировать образование опухоли, когда вводятся животным. Не существует единого механизма, описывающего переход клетки от нормального фенотипа к злокачественному. К образованию опухоли может привести большое число изменений в клетке. Объединение процессов иммортализации и трансформации клеток в культуре может обеспечить парадигму образования опухоли in vivо. Можно надеяться, что при сравнении трансформированных клеток с нормальными удастся идентифицировать генетическую основу образования опухоли и найти понимание фенотипических изменений, происходящих при конверсии. Определенные события конвертируют нормальные клетки в трансформированные. Эти события могут запускаться факторами внешней среды (канцерогены) или генетическими изменениями. Возникновение рака у человека в зависимости от возраста предполагает 6-7 молекулярных событий в течение 20-40 лет. Агентами, увеличивающими частоту конверсии нормальных клеток в трансформированные, являются канцерогены. В зависимости от стадии развития рака их делят на инициаторы и промоторы. К настоящему времени известно два класса генов, мутации в которых вызывают трансформацию: протоонкогены и раковые супрессорные гены. Впервые онкогены были обнаружены в вирусах, вызывающих рак. Позднее оказалось, что основная часть из них имеет клеточных двойников, которые выполняют обычные клеточные функции. Клеточные гены называются протоонкогенами и в определенных случаях мутации в них вызывают развитие опухоли. К настоящему времени идентифицировано более ста протоонкогенов. Они разделены на несколько групп, от генов, кодирующих трансмембранные белки, до генов, кодирующих факторы транскрипции. Онкогены могут изменять свои свойства следующим образом: 1. Постоянной активацией их функции, которая в норме должна быть подавлена. 2. Экспрессия гена в клетке, в которой он обычно не экспрессируется 3. Переэкспрессия в обычной ткани, что может быть результатом мутации Раковые супрессорные гены выявлены в форме делеций или других инактивирующих мутаций. Наиболее ярким доказательством их онкогенности являются некоторые разновидности рака, возникающие при потере обоих аллелей этих генов. Известно несколько десятков РСГ. Их функцией является сдерживание клеточного цикла и роста клеток.
Вирусы, вызывающие рак
Одной из причин, вызывающей трансформацию клеток, может быть вирусная инфекция. Существует множество раковых вирусов, содержащих как ДНК, так и РНК. Примеры трансформирующих вирусов и их свойства представлены в таблице 7:
|
Класс вируса
| Тип вируса
| Размер генома т.п.н
| Онкогены
| Происхождение онкогена
| Действие онкогена
|
| Вирус полиомы
| дцДНК
| 5-6
| Т-антигены
| Ранний вирусный ген
| Инактивация РСГ
|
| Вирус папилломы (HPV)
| дцДНК
| 8
| Е6 и Е7
| Ранний вирусный ген
| Инактивация РСГ
|
| Аденовирус
| дцДНК
| 37
| Е1А и Е1В
| Ранний вирусный ген
| Инактивация РСГ
|
| Ретровирус
| оцРНК
| 6-9
| Индивидуальные
| Клеточное
| Активация ПО
|
| Вирус Эпштейна-Барра
| дцДНК
| 160
| BNLF-1
| Летальный вирусный ген
| Инактивация РСГ
|
В зависимости от ответа на вирусную инфекцию клетки делятся на два класса: 1. Пермиссионные (позволяющие) клетки продуктивно инфицируются, то есть в них происходит полный жизненный цикл вируса, сопровождающийся репликацией вируса, лизисом клетки и выходом наружу вирусных частиц. 2. Непермиссионные клетки подавляют репликацию вируса. При этом может происходить интеграция вирусного генома в клеточный, что может сопровождаться трансформацией. Трансформацию клеток онкогенными вирусами объединяет общий механизм. Рассмотрим их более подробно.
Вирус полиомы – малый ДНК-содержащий вирус, найденный у мышей. Его аналоги найдены у макаки резус (вирус SV40) и человека (вирусы BK и JC). В пермиссионных клетках естественных хозяев они не вызывают трансформации. Например, вирусы ВК и JC онкогенны для грызунов, но не человека. Геном вирусов разделен на две части – раннюю и позднюю в соответствии со временем ее активной экспрессии в жизненном цикле вируса. В ранней области закодированы два белка – большой и малый Т-антиген (Tumor), транскрибируемые с одного гена в результате альтернативного сплайсинга. В пермиссионных клетках они инициируют репликацию вирусной ДНК и стимулируют синтез ДНК и экспрессию генов хозяина, в том числе и контролирующих пролиферацию. В непермиссионных клетках, где репликация вируса подавлена, повышенная пролиферация может приводить к трансформации.
Вирус папилломы – малый ДНК вирус, вызывающий эпителиальные опухоли. Известно 75 видов вируса HPV (Human Papilloma Virus), многие из которых связаны с доброкачественным ростом, например, возникновением бородавок. Некоторые же из этих вирусов вызывают рак. В частности, цервикальный рак может быть связан с экспрессией вирусных белков Е6 и Е7, иммортализующих клетку путем подавления активности Rb и р53 соответственно.
Аденовирус человека был изолирован из аденоидов. Сходные вирусы найдены у других млекопитающих. Это большая группа близкородственных вирусов, состоящая из более 80 индивидуальных членов. Наиболее охарактеризованы аденовирусы человека, так как они вызывают простудные заболевания. Эти вирусы способны инфицировать большое число клеток. Клетки человека являются пермиссионным, и, следовательно, продуктивно инфицируются. Все аденовирусы способны трансформировать лишь непермиссионные клетки, к которым относятся клетки некоторых грызунов. Наиболее эффективно трансформирующее действие аденовируса проявляется на новорожденных грызунах. Трансформирующее действие аденовируса аналогично действию вируса полиомы и связано с подавлением действия Rb и р53 продуктами ранних генов Е1А и Е1В.
Вирус Эпштейна-Барра (EBV) – один из представителей семейства вирусов герпеса, связанный со многими болезнями человека (мононуклеозис, назофарингальная карцинома, лимфома Беркита и другие лимфопролиферативные болезни). В-лимфоциты человека инфицируются этим вирусом in vitro и становятся иммортализованными. Вирусную ДНК находят и в трансформированных клетках. Остается до конца неизвестным, какие гены EBV вызывают трансформацию. Идентифицирован белок BNLF-1, который, видимо, активирует определенные клеточные гены.
Ретровирусы кардинально отличаются от вирусов, упомянутых ранее, по их способности переносить генетическую информацию не только горизонтально, но и вертикально. Горизонтальный перенос – это нормальный процесс вирусной инфекции, при котором увеличивается число пораженных клеток у одного хозяина. Вертикальный перенос связан с интеграцией вируса в половые клетки в качестве эндогенного провируса. Он наследуется по законам Менделя. Жизненный цикл вируса осуществляется при помощи обратной транскрипции: РНК- оцДНК-дцДНК – интеграция в геном- инфекционная РНК. Интеграция в геном приводит к вертикальной трансмиссии провируса. Экспрессия провируса может генерировать ретровирусные частицы, которые передают генетическую информацию горизонтально. По способности вызывать рак опухолевые ретровирусы делятся на две большие группы: 1. Недефективные вирусы, которые имеют обычный для ретровирусов жизненный цикл. Они имеют длинный латентный период и часто связаны с возникновением лейкемий. Существует две классические модели: FeLV (Feline leukemia virus) и MMTV (mouse mammary tumor virus). Опухолеобразование не связано с определенными вирусными ПО, а со способностью вируса активировать клеточные ПО. 2. Быстро трансформирующие вирусы передают новую для клетки генетическую информацию в виде ПО. Если в вирусе не содержится онкоген, то вирус не представляет опасности. ПО становится оригинальным клеточным геном. Быстро трансформирующие вирусы быстро вызывают рак и могут трансформировать клетки in vitro. Ретровирус захватывает клеточный ген путем обмена своей собственной последовательности на клеточную. Такая трансдукция вируса имеет два очень важных свойства: 1. Такой вирус, содержащий клеточный ген, обычно не может сам реплицироваться, так как вирусным генам для репродукции не нужен обмен с клеточным геном. Все такие вирусы дефектны, но они могут инфицировать с помощью «помощника» – вируса дикого типа, который обеспечивает функции, потерянные при рекомбинации. 2. Во время инфекции трансдуцирующий вирус несет клеточные гены, которые получены им в результате рекомбинантных событий и их экспрессия может повреждать фенотип инфицированной клетки. Вирус, несущий информацию о росте клетки, имеет преимущество в будущем цикле инфекции. После захвата вирусом клеточного гена, в нем может случиться мутация и его влияние на фенотип клетки усилится. Конечно, трансфекция не является единственным механизмом влияния ретровируса на клетку хозяина. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1 или HIV-1) инфицирует и убивает Т -лимфоциты, снижая таким образом активность иммунной системы и индуцируя СПИД. ВИЧ не трансформирует клетки, однако больные часто страдают некоторыми видами рака, в частности лимфомами и саркомой Капоши. В вирусах идентифицировано более 30 клеточных онкогенов. Обычно вирусы несут один онкоген. Вирусный онкоген обозначают как v-onc, а клеточный – c-onc. Существует две модели, объясняющие различие между вирусными и клеточными онкогенами. Количественная модель предполагает, что вирусные онкогены качественно не отличаются от клеточных, но их экспрессия повышена или ее не возможно выключить. Качественная модель предполагает, что клеточные онкогены действительно теряют онкогенные свойства, но могут быть конвертированы мутацией в онкоген. Каждый онкоген может вести себя в соответствии с какой-либо из этих двух моделей. Об онкогенном потенциале трансформирующих вирусов свидетельствуют следующие факторы: 1. Мутации в вирусных онкогенах понижают их трансформационную активность 2. Обнаружены события, при которых клеточный онкоген становится онкогеным. Например, это происходит при изменении последовательности клеточного онкогена. Прямые доказательства того, что экспрессия вирусных онкогенов сопровождается трансформацией, получены на примере вируса саркомы Рауса. Чувствительные к температуре мутации в v-src при повышении температуры возвращали клетки от трансформированного фетотипа к нормальному, тогда как понижение температуры реверсировало трансформированный фенотип. Src – пример гена, свойства которого напоминают c-onc. V-src онкогенен при низких уровнях экспрессии белка, c-src – при высоких (более 10 от нормы). Некоторые ПО слабо онкогенны при повышении их экспрессии, но найденные изменения в v-onc или появляющиеся изменения в c-onc обладают более эффективной трансформирующей способностью (Например, ras и myc). В некоторых случаях v-onc образуются при потере последовательностей, кодирующих С-конец или N-конец (или оба), вероятно, в результате рекомбинантных процессов. Потеря этих областей может устранять регуляторный контроль над v-onc, который в норме лимитирует активность c-onc. Такие изменения в последовательности необходимы для src. V-src – онкоген при низкой концентрации, c-src – не онкоген даже при относительно высоком содержании белка (в десять раз больше нормы). Концепция, что ОГ активируются от ПОГ – важная парадигма для рака животных. У человека в большинство событий вирусные интермедиаты не вовлечены в процесс трансформации.
Протоонкогены и онкогены
Можно исследовать c-onc в опухолях. Если есть специфический ген, то он должен трансформировать клетки. Часто в модельных экспериментах используется культура фибробластов мыши 3Т3. При их трансформации появляется фокус. Трансформирующая сила гена может характеризоваться эффективностью появления фокусов. Высокоэффективный ген – больше 100 фокусов/нг ДНК/106 клеток. Низкоэффективный – меньше 10 фокусов/нг ДНК/106 клеток. Трансформирующая ДНК изолируется лишь из опухолей. Рассмотрим некоторые примеры. В семейство c-ras входят три гена H-ras, K-ras, N-ras и один псевдоген. Они отличаются от вирусного гена по трем-семи аминокислотам. У человека наиболее часты мутации в 12 и 61 кодоне, причем в с-H-ras и с-K-ras генах в 12 позиции часто обнаруживается мутация. Это предполагает, что Ras белки имеют высокий потенциал конвертировать в опухолеродные формы через мутацию в одном или нескольких кодонах у крысы и у человека. Следует заметить, что нахождение этих мутаций в опухоли еще не доказательство их причастности к ее возникновению. Во многих случаях работает общий принцип – аминокислотная замена может конвертировать клеточный ПО в ОГ. Практически любая мутация в 12 и 61 кодоне может конвертировать ras ПО в активный онкоген. Все три гена ras в 12-ой позиции имеют глицин. Если
in vitro егозаменить на любую аминокислоту кроме пролина, то клеточная культура будет трансформироваться. В 61-ой позиции находится глютамин. Его замена приводит к аналогичному результату (кроме замены на пролин и глютамат). Некоторые c-ras имеют мутацию в интроне, в результате скорость процессинга мРНК возрастает в десять раз. Есть раковые культуры с амплифицированным ras геном. Ras белки могут трансформировать клетки, но количественный эффект их действия до сих пор не описан. Не всегда трансформация связана со структурной частью онкогена. Есть примеры, связанные со вставкой ретровируса в клеточный геном рядом с c-myc геном. Ген c-myc состоит из трех экзонов и длинного транслирующего участка. Элемент LTR вируса работает как промотор, и транскрипция гена c-myc может многократно усилиться. В этом случае кодирующая последовательность c-myc не изменяется, а онкогенные свойства появляются из-за увеличения экспрессии и потери контроля над ней. Другим механизмом активации ПО является транслокация, сопровождающаяся повреждением ПО в точке разрыва. Подобное происходит при лимфоме Беркита – появлении недифференцированных В-лимфоцитов. В этом случае чаще всего c-myc из хромосомы 8 переносится в IgH локус хромосомы 14. Такая комбинация вызывает усиление экспрессии c-myc, так как клетка активно производит иммуноглобулины, что и приводит к задержке лимфоцитов в незрелом состоянии. У трансгенных мышей с c-myc геном, находящимся под контролем энхансера IgH, развивается лимфома. Трансгенные мыши, несущие c-myc под контролем LTR ретровируса, имеют опухоли и в других органах. Это предполагает, что при увеличении экспрессии c-myc трансформируется тот тип клеток, в которых этот эффект присутствует. То есть трансформирующая активность c-myc зависит от механизма его активации, а не от его внутренних свойств. Нужно отметить, что транслокация не всегда приводит к тому, что поврежденный ген становится онкогенным. Транслокация может действовать как энхансер, активирующий другие гены по соседству. Найдено множество трансформаций в Т и В-лимфоцитах, в которых идентифицированы другие онкогены. В некоторых случаях транслокация генерирует гибридные гены, в которых активная единица транскрипции разрушается. В результате экзоны первого гена могут быть связаны с другими генами. В таких случаях существуют две потенциальные причины онкогенности: 1. Онкогенная часть белка может активироваться независимо от другой части. Переэкспрессия под новым управлением – это модель c-myc. 2. Другой партнер в гибридном гене может иметь усиливающий эффект, который вызывает выход из функции в части белка, кодируемого ПО. Примером такой транслокации может служить Филадельфийская хромосома, которую находят при хронической миелогенной лейкемии (CML). Это транслокация 5000 kb области от конца хромосомы 9, несущей c-abl, на область bcr (break-point claster region) хромосомы 22. Последний обнаруживается при другой болезни – острой лимфобластной лейкемии (ALL), когда в транслокацию вовлечен ген bcr. При CML образуется смешанный белок массой 210 кДа, из них часть bcr составляет 70 кДа. При ALL, соответственно, 185кДа и 45кДа. Остальную часть этих белков составляет c-abl с потеряной N-концевой частью. Часть белка bcr, закодированная в первом экзоне, обладает серин/треонин киназной активностью. Белок фосфорилирует сам себя, и фосфорилированная часть обладает способностью взаимодействовать с SH2 доменом c-abl. Возможно, происходит изменение конформации abl и активация его онкогенного потенциала. Изменения в N-концевой области вызывают онкогенность v-abl, трансформирующей версии гена, найденной в ретровирусах. С-abl кодирует тирозин киназу, активность которой необходима для трансформирующего потенциала в онкогенных вариантах. Делеция или замена N-конца усиливает как киназную активность, так и трансформирующие способности. Таким образом, N-концевой домен регулирует киназную активность, а его потеря вызывает ее активацию. Приведем примеры других протоонкогенов, экспрессия которых увеличивается при трансформации. Белок v-rel идентифицирован как трансформирующий фактор вируса птичьего (индюк) ретикулоэндотелиоза. Он высоко онкогенен для цыплят и вызывает В-клеточную лимфому. V-rel является укороченной версией c-rel, потерявшей 100 аминокислотных остатков на С-конце и имеет малое число точечных мутаций в оставшейся последовательности. Семейство генов rel регулирует транскрипцию при созревании лимфоцитов. NF-kB – фактор транскрипции, представляющий собой димер субъединиц р65 и р50. Его регуляция осуществляется I-kB. Когда I-kB фосфорилируется, происходит освобождение NF-kB, который идет в ядро и активирует гены, в промоторе или энхансере которых имеется kB мотив.
