Порядок проведения количественного исследования аналогичен качественному анализу за исключением использования на этапе ПЦР дополнительных образцов - калибраторов, входящих в набор реагентов, с известной концентрацией ДНК S . pneumoniae и ДНК ВКО, которые указываются во вкладыше к набору реагентов. Особенности анализа результатов амплификации помимо этого связанны с расчетом концентраций ДНК S . pneumoniae и ДНК внутреннего контрольного образца (ВКО).

В результате исследования учитывают эффективность экстракции (потери ДНК при экстракции) для чего определяют соотношение концентрации ДНК ВКО до экстракции и расчетную концентрацию ДНК ВКО после экстракции. Полученное значение используют при расчете реальной концентрации ДНК S . pneumoniae в исследуемом образце. Дополнительным контролем проведения количественного исследования служит расчет концентрации ДНК ПКО и сравнение полученного значения с истинной концентрацией ДНК в препарате ПКО, которая указана во вкладыше к набору реагентов.

Клинически значимым при исследовании материала от пациетов с подозрением на внебольничную пневмонию, проведенного методом ПЦР в качественном и (или) количественном формате можно считать обнаружение ДНК S . pneumoniae в мокроте (или аспирате из трахеи) в количестве ≥ 10⁵ ГЭ/мл (или копий/мл) (Stralin K et al., 2014). В БАЛ и аутопсийном материале клинически значимой является концентрация 10⁴ - 10⁵ ГЭ/мл (или копий/мл). При исследовании венозной крови любое количество ДНК является значимым. Однако если пациент применял антибиотики до обращения за медицинской помощью, диагностически значимая концентрация может быть ниже.  

6.2.7. Определение серологических типов Streptococcus pneumoniae

Для серотипирования бактериальных культур S . pneumoniae с целью повышения эффективности наблюдения за циркулирующими штаммами возбудителя и оценки эффективности вакцинопрофилактики в настоящее время используют 2 метода лабораторной диагностики: латекс-агглютинацию и ПЦР.

Метод латекс-агглютинации

Порядок проведения исследования аналогичен п. 6.2.4.

Отличия заключается в использовании нескольких латексных реагентов, содержщих сенсибилизированные кроличьи антитела специфичные для определенной серологической группы S . pneumoniae.

Метод ПЦР

Порядок проведения исследования аналогичен п. 6.2.6.

Для определения серотипов S . pneumoniae c помощью ПЦР в режиме «реального времени» может быть использована методика, предполагающая исследование 16 серотип-специфических мишеней в 4 реакционных смесях. Каждая из реакционных смесей содержит праймеры и зонды для проведения ПЦР на амплификаторах с пятью каналами флуоресцентной детекции. Методика предназначена для определения пневмококков, ассоциированных с инвазивными формами инфекции, капсульные антигены которых включены в состав 10- и 13-валентных конъюгированных вакцин. Серотип-специфические праймеры и зонды распределены по реакционным смесям следующим образом:

реакционная смесь №1 - 3, 6BA, 19F, 9VA;

реакционная смесь №2 - 1, 14, 23F, 4;

реакционная смесь №3 - 18, 9NL, 15AF, 11AD;

реакционная смесь №4 - 2, 5, 7AF, 19A.

Каждая реакционная смесь содержит праймеры (Pai et al., 2006) и зонд для амплификации положительного внутреннего контроля – фрагмента гена cps.

Порядок проведения исследования с использованием данной методики, условия проведения амплификации и интерпретации результатов опубликованы в работе К.О. Миронова и соавторами (К.О. Миронов и соавт., 2014). Выбор методики для определения серологических типов S . pneumoniae зависит от их предполагаемого распространения в наблюдаемой популяции на данной территории, эпидемиологической обстановки и проведения иммунопрофилактических мероприятий. В частности, для расширенного эпидемиологического исследования могут быть использованы альтернативные зарубежные или отечественные (Н.А. Маянский и соавт., 2010; К.О. Миронов и соавт., 2011) методики, предполагающие детекцию большего количества серотип-специфических мишеней.

Постаналитический этап