Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора с системой детекции в режиме «реального времени». Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами.

А. Подготовка пробирок для амплификации

А1. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи соответствующего комплекта реагентов.

Общий объем реакционной смеси – 30 (25) мкл, включая объем пробы кДНК – 10 мкл.

1. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-FL для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Убедиться, что воск полностью покрывает раствор на дне пробирок.

2. На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-буфера-А, при этом он не должен проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-FL.

3. В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб ДНК.

4. Поставить контрольные реакции:

5. отрицательный контроль ПЦР (К–) – внести в пробирку 10 мкл K–.

6. положительный контроль ПЦР (К+) – внести в пробирку 10 мкл K+.

7. отрицательный контроль экстракции (ОК) – внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из образца ОКО.

8. положительный контроль экстракции (ПК, если используется в наборе реагентов) – внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из образца ПКО.

А2. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи комплектов реагентов (например, «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F или аналоги).

Общий объем реакционной смеси – 25 мкл, включая объем пробы кДНК – 10 мкл.

1. Разморозить необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-FL. Перемешать содержимое пробирок с ПЦР-смесью-FL, ПЦР-буфером-B и полимеразой (TaqF) и осадить капли кратковременным центрифугированием (1–2 с) с помощью центрифуги/вортекса.

2. Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

3. Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке 10_*(N+1) мкл ПЦР-смеси-FL, 5_*(N+1) мкл ПЦР-буфера-B, и 0,5_*(N+1) мкл полимеразы (TaqF).

4. Перемешать подготовленную смесь на вортексе и осадить капли кратковременным центрифугированием с помощью центрифуги/вортекса.

5. Внести в каждую пробирку по 15 мкл подготовленной смеси.

6. В подготовленные пробирки внести по 10 мкл ДНК, полученных на этапе экстракции.

7. Поставить контрольные реакции:

8. отрицательный контроль ПЦР (К–) – внести в пробирку 10 мкл K–.

9. положительный контроль ПЦР (К+) – внести в пробирку 10 мкл K+.

10. отрицательный контроль экстракции (ОК) – внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из образца ОКО.

11. положительный контроль экстракции (ПК, если используется в наборе реагентов) – внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из образца ПКО.

Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»

1. Запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени») для выполнения амплификации и детекции флуоресцентного сигнала в соответствии с инструкцией к набору реагентов, учитывая рекомендованные каналы для флуорофоров.

2. Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора. Перед установкой в амплификатор планшетного типа необходимо осадить капли со стенок пробирок кратковременным (1–3 с) центрифугированием на центрифуге/вортексе.

3. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала.

4. По окончании выполнения программы приступить к анализу и интерпретации результатов.

Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР c детекцией в режиме «реального времени». Согласно инструкции производителя наборов реагентов устанавливают все необходимые настройки параметров, включая уровень пороговой линии, устранение выбросов (если предусмотрено) и другие, указанные для конкретного набора реагентов. Положительным считают образец, в котором кривая флуоресценции пересекает установленную на соответствующем уровне пороговую линию, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов по определенному каналу детекции. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции. В случае, если экспоненциальный подъем не очевиден (линия флуоресценции похожа на прямую линию) следует проанализировать необработанные (сырые данные). Если в сырых данных экспоненциальный подъем флуоресценции отсутствует, результат по этой пробе считать отрицательным.

В. Интерпретация и выдача результатов исследования при использовании амплификации с детекцией в режиме «реального времени»

Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительных и отрицательных контролей.

Принцип интерпретации результатов следующий:

- ДНК искомого возбудителя обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для соответствующего флуорофора определено значение порогового цикла Ct, не превышающее указанное во вкладыше к набору реагентов граничное значение.

- ДНК искомого возбудителя не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналам для соответствующего флуорофора не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct, а значение порогового цикла Ct по каналу для детекции ВКО не превышает указанное во вкладыше к набору реагентов граничное значение.

- Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по каналу для детекции ДНК возбудителя, и по каналу для детекции ВКО значение Ct также не определено (отсутствует) или превышает указанное граничное значение. В этом случае требуется повторить ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК. При повторении результатов рекомендовать повторный сбор материала для анализа.

- Результат анализа сомнительный, если для данной пробы значение порогового цикла Ct по каналу для детекции ДНК возбудителя превышает указанное во вкладыше к набору реагентов граничное значение, а значение порогового цикла Ct по каналу для детекции ВКО не превышает указанное во вкладыше к набору реагентов граничное значение. В этом случае требуется повторить ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК. При повторении результатов или получении значения порогового цикла Ct по каналам для детекции ДНК возбудителя менее граничного, образец считать положительным.

Граничные значения Ct указываются во вкладыше, прилагаемом к набору реагентов. Подробная информация по программированию приборов, анализу и интерпретации результатов также указана в методических рекомендациях по применению конкретного набора реагентов.

По значению Ct, полученного для исследуемого образца, можно косвенно судить о количестве ДНК возбудителя в пробе: чем меньше значение Ct, тем больше ДНК в исследуемой пробе, и наоборот. То есть, если значение Ct в исследуемом образце равно или меньше, чем значение Ct для К+ по данному каналу детекции, можно считать, что количество ДНК возбудителя большое; если значение Ct в исследуемом образце больше, чем значение Ct для К+ по данному каналу детекции, можно считать, что количество ДНК возбудителя небольшое; если кривая флуоресценции пересекает пороговую линию на последних циклах амплификации – в пробе содержатся следовые количества ДНК возбудителя.