Оборудование:

- ламинарный бокс 2-го класса биологической безопасности;

- микроскоп бинокулярный с осветителем, набором объективов и окуляров;

- термостаты электрические для выращивания бактерий, поддерживающие температуру в камере в пределах от +35 до +45 (± 1) °С;

- центрифуга лабораторная;

- весы лабораторные общего назначения;

- анаэростат или CO₂-инкубатор, поддерживающий температуру в камере в пределах +37 (± 1) °С, содержание CO₂ на уровне 3 - 7 %;

- дистиллятор;

- стерилизатор паровой электрический;

- холодильник фармацевтический, поддерживающий температуру от +4 до + 8 °С для хранения культур, биологических субстратов и реагентов;

- спиртовки (газовые горелки);

- прибор для покраски мазков (автоматический аналог);

- дозаторы переменного объема полуавтоматические (автоматические);

- счетчики колоний (автоматический аналог);

- водяная баня (сухо-воздушный инкубатор);

- дополнительное оборудование для автоматизации процесса выделения и изучения микроорганизмов (аппараты средоварения, станции первичного посева, анализатор крови, автоматические «ридеры» для считывания результатов тестирования бактериальных культур)

- приборы и программы информационного обеспечения (компьютер, принтер, электронные информационные системы).

Реагенты

- транспортные питательные среды (Амиеса с углем и без угля, Стюарта, Кери Блейра и пр.);

- готовые питательные среды для посева и инкубации крови;

- питательные среды для культивирования S . pneumoniae на базе обогащенных субстратов универсальные (кровяной агар, шоколадный агар, эритрит-агар, тиогликолевая среда и др.), дифференциально-диагностические (CNA-агар), хромогенные;

- наборы реагентов для окраски микропрепаратов;

- диагностические наборы реагентов (коммерческие тест-системы) для идентификации S . pneumoniae по биохимическим свойствам.

Средства дезинфекции:

Дезинфицирующие средства в концентрации и времени экспозиции, указанных в инструкциях по их использованию.

             Лабораторная посуда и расходные материалы:

- одноразовые стерильные контейнеры с устойчивым основанием, тампоны-зонды (Swab) для сбора и транспортирования образцов биологического материала (мокроты, плевральной жидкости, трахеального аспирата, бронхоальвеолярного лаважа, мочи, ликвора, секционного материала и пр.); 

- чашки бактериологические (Петри) для выращивания микробиологических культур;

- шпатели, тампоны-зонды для посева, пересева биологических материалов, выросших культур микроорганизмов;

- штативы и поддоны для пробирок и контейнеров, чашек Петри;

- кюветы и штативы-рельсы для фиксации и окрашивания мазков;

- петли бактериологические;

- наконечники стерильные для дозаторов переменного объема;

- посуда мерная лабораторная стеклянная и пластиковая;

- газогенераторные пакеты;

- пипетки пластиковые пастеровские градуированные для стандартизации объема и переноса жидкостей;

- перчатки резиновые;

- контейнеры и емкости для обеззараживания медицинских отходов.

Посев первичного материала проводят на специальные питательные среды с высоким содержанием аминного азота и нативного белка животного происхождения.

Для материала, не содержащего нормофлору, используют кровяной, шоколадный, Колумбийский агары, а также полужидкую тиогликолевую среду в качестве среды обогащения (в которой посевной материал оставляют на сутки в стандартном режиме инкубации при + 35° +37°С 16-20 часов.

При выделении пневмококка из «нестерильного материала предпочтение отдают питательным средам со специальными ингибирующими добавками (CNA-агар).

В плотной среде необходимо предусмотреть присутствие дефибринированной крови барана для оценки гемолитических свойств пневмококка. С учетом сложившейся лабораторной практики допускается использование человеческой крови (эритроцитарной массы). При этом следует помнить о возможности получения сомнительных результатов.

В первый квадрант вносят материал, проворачивая тампон и придавливая его к поверхности агара. Жидкий материал вносят стерильной пипеткой или наконечником дозатора в объеме 0,05 мл (1 капля).

 Во второй и следующие квадранты материал засевают микробиологической петлей, захватывая площадку предыдущего квадранта лишь двумя штрихами. Между посевами на квадранты петлю стерилизуют прожиганием, либо меняют ее при использовании одноразовых петель. Не допускается касания краев чашки Петри. На каждом квадранте производят по 10 штрихов (рис. 2.).

Рис. 2. Посев методом истощающих штрихов (квадрантов)

Инкубацию посевного материала, по возможности, осуществляют в атмосфере c повышенным содержанием СО₂. Наиболее распространенным ме­тодом создания таких условий является использование эксикатора, в кото­рый помещается зажженная свеча, при горении утилизи­рущая кислород. Когда свеча гаснет, концентрация СО₂ достигает 3% (не допускается использование свечи с красителями). Однако наиболее эффективным является применение СО_2­ тер­мостата или анаэростата со специальными газогенераторными пакетами.

Через 16-20 часов инкубации в стандартном режиме S . pneumoniae формируют мелкие, округлые, блестящие, бесцветные с ровным краем и мягкой консистенции колонии с зоной α-гемолиза. В некоторых случаях (чаще при использовании человеческой крови или эритроцитарной массы) может наблюдаться зона гемолиза промежуточной формы (между α- и β-).

В зависимости от степени выраженности капсулы, отмечено несколько типов колоний.

Колонии с сильно развитой капсулой (преимущественно у S . pneumoniae серотипа 3 имеют несколько миллиметров в диаметре, напоминают каплю масла на агаровой поверхности и бывают настолько слизистыми, что их идентификация не представляет существенных проблем. В полужидкой питательной среде такие изоляты, как правило, дают нежный хлопьевидный осадок (комочек ваты).

Колонии с менее выраженной капсулой обычно небольших размеров, их выделение сопряжено с определенными трудностями. При длительной инкубации (до 48ч) центральная часть колонии может опускаться, давая характерную «блюдцеобразную форму» до полного уплощения и образования на поверхности агара "шляпки гвоздя", что объясняется действием пневмококковых аутолизинов.

Авирулентные формы пневмококков на плотных средах формируют гладкие, компактные, точечные колонии. В полужидкой среде имеют придонно-пристеночный рост. Именно такие формы необходимо, прежде всего, идентифицировать не только от близких видов стрептококков, но и от других представителей бактериальной флоры (Neisseria, Haemophilus, Corynebacterium).

Фенотипическую идентификацию S . pneumoniae проводят по таким признакам, как отсутствие каталазной и оксидазной активности, а так же по специфическим методам, основными из которых являются чувствительность к оптохину (зона задержки роста вокруг диска превышает 14 мм при концентрации препарата в диске 6 мкг и зоны задержки 15 мм при концентрации 5 мкг) и лизис бактериальной культуры в присутствии солей желчи (наличие зоны лизиса вокруг коммерческого диска с желчью в концентрации 3 мкг). Использование нативной, сухой или медицинской желчи не обеспечивает достоверных результатов, поскольку такая желчь не стандартизована по содержанию желчных кислот.

Дополнительным тестом может служить отсутствие роста бактериальной культуры пневмококка при + 45° С в стандартном режиме инкубации (тест проводят методом посева чистой культуры в полужидкую среду для контроля стерильности, разлитую в пробирку в объеме 9-10 мл). У прочих зеленящих стрептококков, составляющих нормофлору дыхательных путей (S. mitis , S . oralis , S . salivarius , S . mutans и др.) в этих условиях инкубации в питательной среде будет наблюдаться хороший бактериальный рост.

Основные дифференцирующие признаки Streptococcus pneumoniae от других представителей семейств Streptococcaceae и Enterococcus, схожих по тинкториальным и культуральным свойствам и дающих на агарах с содержанием крови барана и человека зоны α- или β- гемолиза представлены в таб. 1 и таб. 2.

Таблица 1.

Дифференцирующие признаки штаммов Streptococcus pneumoniae

чувствительных к оптохину от других представителей семейства Streptococcaceae

Таблица 2.

Дифференцирующие признаки штаммов Streptococcus pneumoniae