Аскорбатоксидаза относится к классу оксидоредуктаз; она катализирует окисление аскорбиновой кислоты (витамин С) в дегидроаскорбиновую кислоту. В состав аскорбатоксидазы входит медь.

Этот фермент содержится в значительных количест­вах в тыкве, кабачках, салате, фасоли и ряде других ра­стений.

Принцип метода. Активность аскорбатоксидазы опре­деляют йодометрическим измерением количества аскор­биновой кислоты.

Ход работы

1. 20 г мякоти тыквы растирают в ступке с 10–15 мл 0,15 М фосфатного буфера с рН около 7.

2. Растертую массу переносят в широкогорлую мерную колбу на 50 мл с доведением объема взвеси до мет­ки фосфатным буфером.

3. Через 1 час настаивания содер­жимое колбы фильтруют и фильтрат используют в ка­честве препарата фермента.

4. Две порции препарата по 10 мл помещают в колбоч­ки на 50 мл и одну из них нагревают до кипения и кипя­тят 1–2 минуты для инактивации фермента, а затем ох­лаждают.

5. Колбы ставят в термостат при температуре 37°С и после добавления 10 мл раствора аскорбиновой кислоты инкубируют смесь в течение 30 минут.

6. Затем содержимое обеих колб нагревают до кипячения и после охлаждения доводят водой до метки.

7. По 10 мл прозрачной жидкости переносят в кониче­ские колбы емкостью 100 мл и добавляют по 5 мл 10%-ного раствора KJ, 10 мл 5%-ной НС1, 10 капель 1%-ного раствора крахмала и 10 мл 0,01 н. KJО₃ в каждую из колб.

8. Через пять минут после прибавления последнего ре­актива растворы титруют 0,001 н. Na₂S₂О₃ до исчезнове­ния синей окраски.

Вычисление результатов. Результаты определения проводят по следующей формуле:

х = (а - б) · Т · 0,088

Н

где  х – активность аскорбатоксидазы, выраженная в миллиграммах окисленной аскорбиновой кис­лоты под действием фермента из 1 г расти­тельной ткани за период инкубации;

а – миллилитров 0,001 н. раствора гипосульфита, израсходованного на оттитровывание избытка йода в опытном определении;

б – миллилитров 0,001 н. раствора гипосульфита, израсходованного на титрование контрольной пробы;

Т – поправка к титру 0,001 н. Na₂S₂03;

0,088 – количество миллиграммов аскорбиновой кис­лоты, соответствующее каждому миллилитру 0,001 н. Na₂S₂0₃;

Н – навеска вещества, соответствующая объему препарата, взятого для титрования (в г).

Оборудование и реактивы: 1) термостат; 2) фарфо­ровая ступка; 3) мерные колбы на 25 и 50 мл; 4) кони­ческие колбы на 100 мл; 5) 0,01 н. KJО₃; 6) KJ 10%-ный; 7) 0,001 н. Na₂S₂О₃; 8) крахмал, 1%-ный раствор; 9) фос­фатный буфер, 0,15 М с рН=7,0; 10) аскорбиновая кис­лота (раствор с содержанием 1 мг в 1 мл).

Определение активности тирозиназы

Тирозиназа относится к классу оксидоредуктаз, к группе фенолоксидаз. Этот фермент, в отличие от других ферментов этой группы, обладает групповой (относитель­ной) специфичностью и катализирует окисление не толь­ко монофенолов, но и полифенолов. Тирозиназа широко распространена в растительных организмах. По своей природе она является медьсодержащим протеидом.

За каталитическим действием тирозиназы можно на­блюдать по реакции окисления тирозина кислородом воздуха в присутствии препарата тирозиназы. В процес­се окисления из тирозина образуется красный пигмент гелохром, а затем темный пигмент меланин.

Ход работы

1. Клубень картофеля растирают на терке и навеску 1–2 г растительной массы заливают 5 мл во­ды и тщательно перемешивают.

2. Полученную взвесь фильтруют через 2 слоя марли и фильтрат используют как препарат фермента.

3. В две пробирки наливают по 1 мл препарата фермен­та.

Содержимое одной из них (для «холостого» опреде­ления) нагревают до кипения и кипятят 1–2 минуты, а затем охлаждают.

4. В обе пробирки добавляют по 1 мл 1%-ного раствора тирозина и при периодическом (через 3 минуты) перемешивании встряхиванием реакционную смесь инкубируют при температуре 40°С.

За окраской жидкости наблюдают в пробирках. Жидкость в пробирке с активной вытяжкой из картофе­ля постепенно становится сначала розовой, затем бу­рой и, наконец, черной. В «холостой» пробе с инактивированным ферментом цвет жидкости в пробирке не изменяется.

Результаты наблюдения фиксируют в тетради и делают выводы.

Оборудование и реактивы: 1) терки; 2) пробирки; 3) пипетки; 4) термостат водяная баня; 5) тирозин, 1%-ный раствор.

       Определение гидролитической активности липазы

Липазы, относящиеся к группе эстераз, являются ферментами, катализирующими расщепление сложноэфирной связи между глицерином и жирными кислотами в жире. В результате действия липаз жир расщепляется на глицерин и свободные жирные кислоты.

Липазы распространены во многих растительных объ­ектах, они присутствуют почти во всех органах и тканях растений, но больше всего их в семенах, особенно в се­менах масличных растений. Активность липаз из разных растений различна, они отличаются также по оптимуму рН, температурному оптимуму и ряду других свойств. При прорастании семян липазы расщепляют содержа­щийся в них жир и продукты распада подвергаются за­тем дальнейшим превращениям.

Активность липаз имеет большое значение при хране­нии муки и круп, особенно содержащих много жира. При увеличении влажности этих продуктов и повышенной температуре хранения липазы быстро расщепляют жиры с образованием свободных жирных кислот, что приводит к повышению кислотности продуктов и их быстрой пор­че, прогорканию.

Принцип метода. В качестве источника фермента ис­пользуется тонкоразмолотый испытуемый материал (ча­ще всего семена масличных растений) или этот же ма­териал, но предварительно обезжиренный эфиром или ацетоном. Так как под действием липаз из жира осво­бождаются жирные кислоты, активность липаз опреде­ляют по увеличению кислотности в реакционной смеси при прямом титровании щелочью RCOOH + NaOH → RCOONa + Н₂О, и показателем активности служит количество щелочи, требующееся для нейтрализации об­разовавшихся жирных кислот. Идеальным субстратом при изучении действия липазы из какого-либо объекта должен был бы являться жир, полученный из того же объекта. Однако в качестве субстратов действия липаз можно пользоваться и другими естественными жирами и маслами различного происхождения.

Ход работы

1. Две навески (по 3 г) размолотых семян тщательно растирают в ступке с песком и перено­сят в конические колбы емкостью 100 мл с притертыми пробками.

2. Ступку смывают 2–3 раза небольшим коли­чеством (по 2–3 мл) воды и в колбы добавляют по 1 мл чистого подсолнечного масла.

В связи с тем, что опти­мум рН большинства растительных липаз равен 4,5–5,0, в реакционную колбу добавляют еще 5 мл ацетатного буфера с рН=4,7 (ацетатный буфер с рН=4,7 готовят сме­шиванием одного объема 1 н. СН₃СООН и одного объе­ма 1 н. CH₃COONa) и несколько капель толуола.

3. Смесь в колбах тщательно перемешивают на механиче­ской мешалке, после чего ставят на 20–24 часа в термостат при температуре 30°С или оставляют

при комнатной температуре. За этот срок значительная часть введенного подсолнечного масла расщепляется липазами, имеющимися в семенах.

Одновременно с используемыми пробами ставят кон­трольные.

4. Для контрольных проб берут также по две на­вески растертого материала и поступают с ними таким же образом, но перед тем, как ставить в термостат, их предварительно кипятят в течение 3–5 минут для ина­ктивации ферментов.

5. По истечении 20–24 часов в конические колбы до­бавляют по 25 мл спирта и 15–25 мл эфира.

6. Содержимое колб встряхивают, дают отстояться и титруют 0,1 н. NaOH в присутствии 0,5 мл 1%-ного спиртового раство­ра тимолфталеина (для неокрашенных экстрактов в ка­честве индикатора можно применять фенолфталеин).

Вычисление результатов. Активность липаз выража­ют в миллилитрах 0,1 н. NaOH на 10 г семян. Расчеты можно проводить по следующей формуле:

х  = (а · Т – б · Т) · 10

 Н

где  х – активность липазы;

а – миллилитров 0,1 н. NaOH, израсходованных для титрования опытного образца; Т – поправка к титру 0,1 н. NaOH; б – миллилитров 0,1 н. NaOH, израсходованных для титрования контрольного (предварительно прокипячен­ного) образца; Н – навеска семян.

Приготовление чистого масла. 300 г подсолнечного масла взбалтывают в делительной воронке с 2%-ным NaOH и дают отстояться. Щелочной раствор сливают. Промывают в воронке несколько раз дистиллированной водой (до отрицательной реакции с фенолфталеином). Затем отстаивают и сушат, пропуская через колонку с хлористым кальцием.

Оборудование и реактивы: 1) ступки фарфоровые диаметром 10 см; 2) колбы конические емкостью 100 мл с притертыми пробками; 3) чистое подсолнечное масло; 4) ацетатный буфер (рН=4,7); 5) этиловый спирт; 6) эфир; 7) толуол; 8) тимолфталеин или фенолфтале­ин, 1%-ный спиртовый раствор. 9) 0,1 н. NaOH.

Контрольные вопросы

1. Особенности строения, свойства и функции ферментов.

2. Классификация ферментов (с примерами).

3. Механизм ферментативного катализа.

4. Зависимость активности ферментов от: температуры реакции, кислотности среды, концентрации субстрата.

5. Активаторы ферментов.

6. Ингибиторы ферментов.

7. Характеристика ферментов: а) 1 класса, входящие в состав зерна и продуктов его переработки; б) 2 класса; в) 3 класса.

8. Промышленное использование растительных ферментов.

9. Иммобилизация ферментов.