Качественные реакции на белки.

Лабораторная работа № 4. Определение белков по методу Лоури.

Колориметрическое определение аскорбиновой кислоты в растительных

продуктах

Учебные вопросы:

1.Состав, строение, классификация белков

2.Функции белков в растении

3.Качественные реакции на запасные белки семян растения

4.Строение и химические свойства витаминов

5.Физиологическая роль витаминов для растений

6.Обмен витаминов в растениях

Содержание белка у различных культур сильно варьирует. Это обусловлено генотипическими особенностями видов, сортов, а также условиями их выращивания. Кроме того, белки неравномерно распределены в тканях растений. Мало белковых веществ в старых стеблях и корнях, тогда как в листьях и семенах может содержаться значительное количество белка. Так, в вегетативной массе клевера, люцерны, вики содержание белка составляет до 20 % на сухое вещество, а в семенах пшеницы, ячменя, кукурузы варьирует в пределах 10–30 %. В семенах бобовых культур, например у сои количество белка может достигать 50 %.

Из семян бобовых и масличных культур достаточно легко получить препараты белков для изучения их химического состава и строения. Выделение белковых веществ из вегетативных органов растений затруднено, так как в них белки прочно связаны с углеводами и другими соединениями.

Экстракция белков из растительной ткани основана на их способности растворяться при разрушении ткани в воде, растворах солей, кислотах и щелочах, буферных растворах. Буферные растворы обеспечивают мягкие условия выделения белков, при которых сохраняется природная структура их молекул. Для выделения большей части белковых веществ (препарат суммарного белка) используют буферные растворы с рН 8.

Существует несколько методов количественного определения белков в растительных тканях. Ниже представлена работа по спектрофотометричес-

кому и колориметрическому методам определения суммарного содержания белка в растительном материале. Цель настоящей работы – определить количество белка в семенах различных зерновых и зернобобовых культур, а также в вегетативной массе растений.

Реактивы и материалы: дистиллированная вода, фосфатный буфер (рН 8), Na₂HPO₄ · 2H₂O, NaH₂PO₄ · H₂O, бисульфид натрия, этиловый спирт, трихлорук-сусная кислота (ТХУ), NaOH, Na₂CO₃, CuSO₄ · 5H₂O, K- или Na-виннокислый, реактив Фолина, альбумин или казеин, фарфоровая ступка и пестик, кварцевый песок, колба Бунзена, ротатор, конические колбы объемом 100 мл, мерные цилиндры, пробирки, морозильная камера, центрифуга.

Ход работы

1. Выделение суммарных белков из семян зерновых и зернобобовых растений

Навеску 1 г сырых проросших семян (пшеница, ячмень, фасоль, горох, люпин, соя) поместить в фарфоровую ступку. Добавить небольшое количество кварцевого песка и тщательно растереть с 40 мл фосфатного буфера (рН 8), содержащего 0,2 % бисульфита натрия и несколько капель этилового спирта. При использовании сухих семян их необходимо предварительно размолоть до состояния муки, и после добавления фосфатного буфера настоять в течение часа.

Для приготовления 0,1 М фосфатного буфера с рН 8,0 необходимо взять 95 мл 0,2 М раствора Na₂HPO₄ · 2H₂O добавить 5 мл 0,2 М раствора NaH₂PO₄ · H₂O и довести объем водой до 200 мл.

Гомогенат количественно перенести в коническую колбу на 100 мл и довести объем фосфатным буфером до 50 мл. Содержимое колб перемешивать на ротаторе в течение 1 ч. По истечении указанного времени колбы достать из ротатора и дать вытяжке отстояться в течение 15 мин. Затем при помощи пипетки из верхней части гомогената осторожно отобрать 10 мл раствора и перенести в центрифужные пробирки. Провести центрифугирование раствора в течение 15 мин при 3000 об/мин при комнатной температуре. По окончании центрифугирования из пробирок отобрать пипеткой 1 мл надосадочной жидкости и перенести в другую пробирку. Туда же необходимо добавить 9 мл фосфатного буфера с рН 8, тщательно перемешать, после чего раствор суммарных белков готов к спектрофотометрированию.

2. Спектрофотометрический метод определения суммарных белков

Раствор белков налить в кварцевую кювету и определить его оптическую плотность при 280 и 260 нм (в качестве раствора сравнения использовать исходный раствор фосфатного буфера). Ароматические аминокислоты тирозин и триптофан, содержащиеся в белках, поглощают свет в области λ = 280 нм. Однако поглощение в этой области имеют и нуклеиновые кислоты, хотя максимум поглощения последних составляет λ = 260 нм. Поэтому для определения концентрации белка в растворах названным методом используют уравнение Варбурга - Христиана:

с = 1,55 × D ₂₈₀ - 0,76 × D ₂₆₀

где с - содержание белка в мг/мл; D ₂₈₀ и D₂₆₀ - оптическая плотность растворов при 280 и 260 нм; 1,55 и 0,76 - расчетные коэффициенты.

Содержание суммарных белков в навеске семян (мг/г сухой массы) рассчитать по формуле:

где c - содержание белка в растворе, найденное по формуле Варбурга - Христиана; V - объем вытяжки в мл; m - масса навески в граммах;

10 - коэффициент, учитывающий разведение вытяжки; 86 - сухая масса воздушно-сухой массы навески семян, %; 60 - сухая масса проросших семян, %.

Результаты оформить в виде таблицы.

Сделать сравнительный анализ полученных результатов.

3. Выделение белков из вегетативных органов растений

Взвесить навеску 0,5 г свежего растительного материала (листья ячменя, клевера, клубни картофеля), измельчить и растереть в фарфоровой ступке с 4-кратным (по массе) количеством фосфатного буфера с рН 8, содержащим 0,2 % бисульфида натрия и несколько капель этилового спирта. Гомогенат залить 10 мл холодной 5 % ТХУ, тщательно перемешать и поместить в холодильник на 20 мин. Затем гомогенат перенести в центрифужные пробирки и центрифугировать в течение 15 мин при 6000 об/мин для осаждения белков. После центрифугирования надосадочную жидкость слить. Осадок промыть охлажденным 96 % этанолом до полного исчезновения зеленой окраски в надоса-дочной жидкости. Повторить центрифугирование и к промытому осадку добавить 2 мл 0,5 н NaOH. Поместить пробирки на 5 мин на кипящую водяную баню, после чего прилить еще 5 мл 0,5 н NaOH, перемешать и центрифугировать 10 мин при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость перенести в мерный цилиндр и измерить общий объем щелочного гидролизата. Количество белка в пробе определить по методу Лоури.

4. Определение белков по методу Лоури

Для определения содержания белков по методу Лоури необходимо предварительно приготовить растворы:

А - 2 % Na₂CO₃ в 0,1 н NaOH;

B - 0,5 % CuSO₄ · 5H₂O в 1 % K-Na-виннокислом;

C - смесь растворов А и В (50:1 по объему);

Е - реактив Фолина.

Отобрать 1 мл щелочного гидролизата, добавить 5 мл раствора С, перемешать и через 10 мин добавить 0,5 мл раствора Е. Смесь выдержать в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего измерить оптическую плотность раствора при 750 нм на спектрофотометре. В качестве раствора сравнения использовать смесь: 1 мл 0,5 н NaOH, 5 мл раствора С и 0,5 мл реактива Фолина.

Для определения содержания белка в растворе необходимо построить калибровочный график по альбумину или казеину.

На аналитических весах взвесить 100 мг альбумина и растворить в 100 мл фосфатного буфера. Из этого стандартного раствора приготовить производные растворы с содержанием белка от 0,05 до 1,0 мг/мл согласно таблице:

Последовательно отобрать 1 мл каждого из растворов альбумина, перенести в чистые предварительно пронумерованные пробирки и добавить, как и в случае опытных растворов, 5 мл раствора С, а через 10 мин 0,5 мл раствора Е. Содержимое каждой из пробирок осторожно перемешать и оставить при комнатной температуре на 30 мин. По истечении указанного времени измерить оптическую плотность растворов при длине волны λ = 750 нм.

По данным, полученным для стандартных растворов, построить калибровочный график (на оси ординат – величина оптической плотности, на оси абсцисс – концентрация белка).

Пользуясь калибровочной кривой найти концентрацию белка в исследуемом растворе. Общее содержание белка в вегетативной части растения (мг/г сырой массы) рассчитать с учетом где с – концентрация белка в исследуемом растворе в мг/мл; V – объем щелочного гидролизата в мл; m – масса навески растительного материала в граммах.

Результаты оформить в виде таблицы.

Сделать выводы.

Контрольные вопросы

1. Протеиногенные и непротеиногенные аминокислоты.

2. Биосинтез и функции непротеиногенных аминокислот.

3. Особенности строения белков и их физиологическая роль в живой клетке.

4. Белки семян и листьев растений.

5. Особенности белкового состава зерновых и зернобобовых культур.

6. Способы обнаружения белка в неизвестном объекте.

7. Проблемы, связанные с изучением растительных белков.