Соединений

Тема 6. Обмен углеводов, липидов и азотистых веществ в организмах

Лабораторная работа № 6.Определение аминного азота формольным титрованием. Определение нитратного азота.

Учебные вопросы:

1. Ассимиляция растениями нитратного азота и причины накопления нитратов в растительной продукции.

2. Особенности действия нитрат- и нитритредуктазы

3. Возможные пути снижения нитратов в растительных продуктах

Азот входит в состав очень многих соединений, содер­жащихся в растениях, –  белков, аминокислот, амидов, нуклеиновых кислот, хлорофилла, алкалоидов, фосфатидов и др.

В зависимости от количества и состава этих соедине­ний в растениях в значительной степени изменяется ка­чество урожая, а следовательно, и питательная ценность растительных продуктов. Кроме того, количество и со­став отдельных групп азотистых соединений в различ­ных органах растений могут указывать на интенсивность и направленность процессов азотного обмена в растени­ях. Поэтому при биохимическом исследовании и опреде­лении качества урожая большинства растений очень ча­сто бывает необходимо определить количество и состав различных групп азотистых веществ.

В зависимости от поставленной задачи образцы рас­тений подвергают анализу с разной степенью дробности. Иногда достаточно определить только общее содержание азота в растениях, а также суммарное количество азота, входящего в состав всех белков и небелковых азотистых соединений (белковый азот и небелко­вый азот). Но в большинстве случаев необходимо иссле­довать состав белковых веществ в растительных тканях, а также содержание и состав отдельных групп небелко­вых азотистых соединений.

В настоящее время разработаны довольно простые методы таких исследований. На странице 4 приведена схема количественного определения различных форм азота.

Определение аминного азота формольным титрованием

Принцип метода. При взаимодействии аминокислот с формалином образуются метиленовые соединения, пред­ставляющие собой кислоты:

RCHCOOH + CH₂O → RCHCOOH

          I                                I             +Н₂О

                                          NH₂                            N=CH₂

Эти кислоты более сильные, чем свободные аминокис­лоты, и они могут быть оттитрованы щелочью. Реакция титрования протекает по следующему уравнению:

RCHCOOH                     RCHCOONа

        I             + NaOH →   I            +Н₂О

                             N=CH₂                             N=СH₂

По количеству щелочи, израсходованной на титрование, можно рассчитать содержание азота аминных групп.

При работе этим методом необходимо учитывать сле­дующее. Полная нейтрализация карбоксильных групп наблюдается лишь при рН 9,1–9,5, что соответствует ярко-красному окрашиванию при использовании в каче­стве индикатора фенолфталеина. Лучше применять тимолфталеии, изменение окраски которого (ярко-синяя) можно наблюдать еще в интервале 9,4–9,7. Аргинин и мочевина не реагируют с формалином и поэтому не учи­тываются при титровании щелочью. Тирозин дает завы­шенные показатели, так как в нем, кроме карбоксильной группы, частично титруется и фенольная группа. Если в растворе имеется повышенное количество аммиака, что наблюдается при анализах гидролизатов белков, то он должен быть предварительно удален в вакууме при тем­пературе 40°С с использованием в качестве щелочи из­весткового молока. Аммиачные соли количественно определяют этим методом, потому что при реакции с формальдегидом аммиак образует гексаметилентетрамин и кислоту, которая затем титруется щелочью:

2(NH₄)₂SО₄ + 6CH₂О →  (CH₂)₆N₄ + 2H₂SО₄ + 6H₂О

Содержание аминного азота в сильно окрашенных жидкостях этим методом определять нельзя, так как очень трудно заметить изменение окраски при титрова­нии. Все это следует учитывать при использовании фор* мольного титрования для определения аминных групп.

Ход работы

В качестве контроля берут 20 мл прокипяченной воды. Воду кипятят для удаления угле­кислоты и затем охлаждают.

1. 20 мл испытуемого и 20 мл контрольного раствора переносят в конические колбы, куда добавляют по 3 капли метилового красного.

2. Со­держимое колб титруют 0,1 н. NaOH до золотисто-жел­той окраски.

3. К нейтрализованным растворам прибавля­ют по 10 мл формольной смеси.                Эту смесь готовят так: к 50 мл 40%-ного формалина добавляют 1 мл 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина и смесь доводят 0,2 н. щелочью до слабо-розового окрашивания.

4. После добавления формольной смеси растворы титру­ют 0,2 н. NaOH.

При этом следует внимательно следить за изменением окраски. Сначала розовая окраска пере­ходит в желтую (изменение цвета от индикатора метило­вого красного, который дает желтое окрашивание при рН=6,2), а потом в розовую (фенолфталеин дает слабо-розовое окрашивание при рН 8,2–8,3).

5. Затем добавляют еще 1–2 капли 0,2 н. NaOH до ясно-красного окрашива­ния (рН=8,8) и еще 2 капли щелочи до интенсивно крас­ной окраски (рН=9,1). Оба раствора титруют до одина­кового тона.

При использовании в качестве индикатора тимолфталеина формольная смесь готовится так: к 50 мл 40%-ного формалина прибавляют 25 мл спирта, 5 мл спиртового раствора тимолфталеина (50 мг в 100 мл 96%-ного спир­та) и 0,2 н. NaOH до слабо-зеленой или синеватой окрас­ки.

Дальнейший ход анализа должен быть таким же, как и при использовании формольной смеси с фенолфталеи­ном, но контрольная и опытная пробы должны быть от­титрованы 0,2 н. NaOH до ярко-синего окрашивания (рН=9,7).

Вычисление результатов. 1 м-экв. аминного азота соответствует

1м-экв. щелочи. При использовании 0,2 н. NaOH 1 мл щелочи соответствует 14 ^.  0,2 = 2,8 мг N. Рас­чет ведут по формуле:

х = (а - b ) ^. T ^. 2,8

где  х – количество аминного азота, содержащееся в 20 мл исследуемого раствора (мг); а – количество миллилитров 0,2 н. NaOH, израсхо­дованного на титрование испытуемого образца; б – количество миллилитров 0,2 н. NaOH, израсходо­ванного на титрование контроля; Т – поправка к титру 0,2 н. NaOH.

Оборудование и реактивы: 1) колбы конические ем­костью 100 мл; 2) пипетки; 3) 0,1 н. NaOH; 4) 0,2 н. NaOH; 5) метиловый красный; 6) фенолфталеин; 7) тимолфталеин; 8) формалин 40%-ный; 9) спирт 96%-ный.