Пероксидаза активирует перекиси, в том числе и пе­рекись водорода. Под ее действием происходит окисле­ние различных фенолов и ароматических аминов. Этот фермент очень широко распространен в тканях расти­тельного и животного происхождения. Наибольшее коли­чество пероксидазы содержится в корнях хрена, редьки и ряда других корнеплодов.

 Принцип метода. Данный метод основан на способности пероксидазы катализировать окисление бензидина с образованием окрашенного соединения р-хиноидинамида.

Ход работы

1. Навеску в 1 г корня хрена, редьки или корнеплодов других растений растирают в ступке с кварцевым песком и затем водой количественно перено­сят в посуду на 10 мл и объем вытяжки доводят до мет­ки.

2. Вытяжку фильтруют через складчатый фильтр.

3. В колбу на 25 мл наливают 2 мл 1 %-ного раствора бен­зидина, 2 мл 3%-ного раствора перекиси водорода и 1 мл приготовленного ферментного препарата; содержимое колбочки перемешивают и оставляют стоять 3 минуты (по песочным часам).

4. Через 3 минуты в колбу прибавля­ют 10 мл 30%-ного раствора NaOH и перемешивают.

Выпавшее в осадок окрашенное соединение растворяют прибавлением 10 мл абсолютного спирта, а затем полу­ченный раствор колориметрируют по стандартному ра­створу.

Стандартный раствор готовят в мерной колбе на 25 мл. В колбу наливают 2 мл 1 %-ного раствора бензи­дина и 3 мл 0,01 н. раствора КМnO₄.

Через 10 минут, когда появившаяся сначала зеленая окраска превратит­ся в темно-красную, прибавляют 10 мл 30%-ного рас­твора NaOH и 10 мл абсолютного спирта.

Вычисление результатов. За единицу пероксидазы принимают такую ее активность, при которой препарат пероксидазы за 3 минуты дает окрашивание, равное стандарту.

 Активность пероксидазы (С) в принятых единицах на 1 г растительной ткани будет равна:

С = h ₁ ^. 10

   h₂

где h₁ – толщина слоя образцового раствора; h₂ – толщина слоя испытуемого раствора.

Оборудование и реактивы: 1) колориметр, 2) колбы на 10 и 25 мл, 3) пипетки, 4) песочные часы на 3 мин., 5) фарфоровая ступка, 6) спирт абсолютный, 7) NaOH 30%-ный, 8) Н₂О₂ 3%-ная, 9) раствор бензидина в 1%-ной ледяной уксусной кислоте, 10) 0,01 н. КМnО₄

Определение активности каталазы

Каталаза относится к первому классу ферментов (оксидоредуктаз) и катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и кислород по уравнению:

                                                                           каталаза

2H₂O₂ → 2H₂O + O₂

Каталаза играет важную роль в жизнедеятельности организмов, так как она разрушает ядовитую для клеток перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания.

Количественное определение каталазы основано на учете перекиси водорода путем титрования ее перманганатом калия. Реакция идет по уравнению:

2KMnO₄ + 5H₂O₂ + 4H₂SO₄ → 2KHSO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O + 5O₂

О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности количеств 0,1 моль/дм раствора КМпО₄, израсходованных на

титрование в контрольном и рабочем опытах.

Ход работы

1. Навеску 5 г свежего растительного материала растирают в ступке со стеклянным песком и 0,3 г СаСО₃

2. Добавляют 20 мл воды и снова тща­тельно растирают до получения однородной массы.

3. Пос­ле этого растертую массу водой количественно перено­сят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем болтуш­ки до метки.

4. Через 30–40 минут смесь фильтруют или центрифугируют.

5. Две порции чистого фильтрата или центрифугата (по 20 мл) помещают в колбы на 100 мл. Одну из колб кипятят 2–3 минуты для инактивации фермента и затем охлаждают.

6. В обе колбы приливают по 20 мл воды и по 3 мл 1%-ного раствора перекиси во­дорода. Время инкубации от 20 до 30 минут.

7. По оконча­нии инкубации к содержимому обеих колб добавляют 4–5 мл 10%-ного раствора H₂SО₄ и титруют 0,1 н. рас­твором КМnO₄ до слабо-розовой окраски, не исчезаю­щей в течение минуты.

По разности между контрольным и опытным титрованием определяют количество разло­жившейся перекиси водорода за время инкубации в рас­чете на 1 г исходного растительного вещества.

x = (а – б) · Т · 1,7

Н

где х – активность каталазы в миллиграммах Н₂О₂, разложившейся за время инкубации на 1 г растительного вещества; а – миллилитров 0,1н. раствора КМnO₄, израс­ходованного на холостое титрование; б – миллилитров 0,1 н. раствора КМnO₄, пошед­шего на опытное титрование; Т – поправка к титру 0,1 н. КМп0₄; 1,7 – количество миллиграммов Н₂О₂, соответствую­щее каждому миллилитру 0,1 н. КМnO₄; Н – навеска растительного материала.  

Оборудование и реактивы: 1) колбочки на 100 мл; 2) мерные колбочки на 100 мл; 3) пипетки; 4) бюретка; 5) фарфоровая ступка.