аскорбиновой кислоты в растительных продуктах

Основным источником аскорбиновой кислоты (витамин С) для человека являются растительные продукты.

Количественный анализ аскорбиновой кислоты представляет собой определенную трудность, и даже сегодня нет универсального метода, который бы не имел недостатков. Любой метод анализа должен давать возможность одновременно определять как саму аскорбиновую кислоту, так и продукты ее окисления и находить четкие различия между этими соединениями.

Наиболее распространенными методами, основанными на ис-пользовании восстановительных свойств аскорбиновой кислоты, являются титриметрические и колориметрические методы анализа.

В основе наиболее популярного титриметрического метода анализа аскорбиновой кислоты лежит реакция ее взаимодействия с 2,6-дихлорфенолин-

дофенолом. Это соединение при нейтральных значениях рН дает синюю окраску, при кислых – розовую, а при взаимодействии с аскорбиновой кислотой образует бесцветный продукт. К сожалению, данный метод чувствителен к присутствию других восстановителей – ионы металлов, редуцирующие сахара, танины и др. Кроме того, при титровании растительных вытяжек имеются некоторые трудности с определением его завершения.

Ниже представлена методика, основанная на фотометрическом определении избытка 2,6-дихлорфенолиндофенола после восстановления определенной его части аскорбиновой кислотой. Оптическая плотность окрашенного раствора определяется строго через 35 секунд после добавления в растительную вытяжку красителя, что дает возможность полностью исключить ошибки, возможные при титриметрическом анализе аскорбата.

Цель настоящей работы – определить количество аскорбиновой кислоты в различных растительных продуктах (овощи, фрукты, ягоды).

Реактивы и материалы : дистиллированная вода, 2 % метафосфорная или 1 % щавелевая кислота, аскорбиновая кислота, 2,6-дихлорфенолиндофе-

нол, NaOH или KOH, фарфоровая ступка и пестик, воронка, бумажные фильтры, мерная колба объемом 100 мл, мерный цилиндр, пробирки, секундомер, спектрофотометр.

Ход работы

Для количественного определения восстановленной аскорбиновой кислоты взять навеску свежего растительного материала массой 5 г, измельчить и перенести в фарфоровую ступку. Залить сырье 10 мл 2 % метафосфорной или 1 % щавелевой кислоты и быстро растереть. Гомогенат количественно перенести в мерную колбу на 100 мл, объем довести до метки той же кислотой. Содержимое колбы тщательно перемешать, после чего профильтровать или отцентрифугировать 10 мин при 1000 об/мин.

Из фильтрата взять три пробы по 10 мл и перенести в чистые пробирки. К каждой пробе добавить 1 мл свежеприготовленного 0,025 % раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола. Для приготовления этого раствора необходимо взять 0,0625 г 2,6-дихлорфенолиндофенола и растворить в 250 мл теплой (45 °С) дистиллированной воды, добавить 6 капель 0,01 н. щелочи.

Если при добавлении 1 мл 2,6-дихлорфенолиндофенола растительная вытяжка полностью обесцвечивается (это наблюдается при значительном количестве аскорбиновой кислоты в исследуемом объекте), то ее нужно разбавить в 2 раза метафосфорной кислотой.

После добавления 2,6-дихлорфенолиндофенола к растительному экстракту включить секундомер, содержимое пробирки тщательно перемешать и быстро залить раствор в кювету толщиной 10 мм.

Через 35 секунд определить оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны λ = 530 нм. В качестве раствора сравнения использовать смесь метафосфорной кислоты и 2,6-дихлор-фенолиндофенола (10:1).

Изменение в интенсивности окрашивания опытного образца про-порционально количеству аскорбиновой кислоты, находящейся в рас-тительной вытяжке. Количественный расчет произвести по калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой необходимо: приготовить стандартный раствор аскорбиновой кислоты концентрацией 1 мг/мл, для этого взвесить 100 мг аскорбиновой кислоты и растворить в 100 мл 2 % метафосфорной кислоты;

– из стандартного раствора приготовить разведения, содержащие от 1 до 100 мкг/мл аскорбиновой кислоты, согласно таблице;

– отобрать 10 мл каждого из растворов аскорбиновой кислоты, перенести в чистые предварительно пронумерованные пробирки, добавить 1 мл 2,6-ди

хлорфенолиндофенола и определить оптическую плотность этих растворов.

Пользуясь калибровочной кривой, найти концентрацию аскорбиновой кислоты в вытяжке. Количество аскорбиновой кислоты в исследуемом материале (мгк/г сырой массы) вычислить по формуле:

где с – содержание аскорбиновой кислоты в 1 мл вытяжки, найденное по калибровочной кривой; V – объем экстракта в мл; m – масса исследуемого материала в граммах.

Результаты представить в виде таблицы.

Сделать анализ полученных результатов.

Определение витаминов В₁ и В₂ в растениях

В растениях содержание витаминов невелико. Вместе с тем отдельные органы и ткани растений способны в большей степени накапливать их в своем составе. Так, овощные и плодовые культуры характеризуются высоким содержанием каротиноидов, витамина Р, аскорбиновой и фолиевой кислотой. В семенах злаковых и зернобобовых культур много рибофлавина, тиамина, ниацина. В зеленых листьях растений накапливаются филлохиноны.

Тиамин, или витамин В₁, в виде тиаминпирофосфата входит в состав окислительных декарбоксилаз кетокислот. Методы определения тиамина основаны на его спектральных свойствах. Максимум поглощения тиамина составляет λ = 250 нм. Продукт окисления тиамина красной кровяной солью в щелочной среде – тиохром флюоресцирует при ультрафиолетовом освещении.

Рибофлавин, или витамин B₂, идентифицирован в природных объектах в виде четырех форм, одна из которых свободный рибофлавин, остальные связаны с нуклеотидами (флавинмононуклеотид, флавинадениндинуклеотид) и с белком. Рибофлавин входит в состав простетической группы флавиновых ферментов, осуществляющих реакции дегидрирования. Окисленная форма рибофлавина так же, как и тиамина, способна флюоресцировать в ультрафиолетовом свете. Максимум поглощения рибофлавина лежит в области λ = 225 нм.

Цель работы – качественное и количественное определение витаминов B₁ и B₂ в вытяжках из вегетативных частей растений, корнеплодов и плодов.

Реактивы и материалы: 0,1 н. раствор H₂SO₄, 10 % трихлоруксусная кислота (ТХУ), 15 % раствор NaOH, 1 % раствор красной кровяной соли K₃[Fe(CN)₆], бромид тиамина (хлорид тиамина), рибофлавин, Na₂S₂O₄ • H₂O либо NaBH₄, 0,01 н. раствор NaOH, металлический цинк, пепсин либо трипсин, изоамиловый спирт, изобутиловый спирт, этиловый спирт, диэтиловый эфир, дистиллированная вода, фарфоровые ступки с пестиками, конические колбы объемом 100 мл, водяная баня, мерные цилиндры, пробирки, делительные воронки объемом 50 мл, бумажные фильтры, термостат, центрифуга, флюоресцентный спектрофотометр.

Ход работы

1. Извлечение витаминов

1. К навеске измельченного растительного материала массой 10–20 г прилить небольшое количество (2–5 мл) 0,1 н. раствора Н₂SO₄, после чего все тщательно растереть в ступке.

2. Растертую массу поместить в коническую колбу на 100 мл, сюда же прибавить 30 мл 0,1 н. раствора Н₂SO₄. Содержимое колбы следует выдержать в течение 20 минут на кипящей водяной бане для экстрагирования витаминов.

3. После завершения процедуры экстрагирования смесь охладить и добавить в колбу 30 мг пепсина либо трипсина для перевода витамина в свободное состояние.

4. Объем гомогената довести до 50 мл раствором серной кислоты. Провести ферментацию в течение 20 ч. в термостате при 38 ºС.

5. По истечении указанного времени вытяжку центрифугировать при 5000 об/мин и отфильтровать под вакуумом. К получившейся надосадочной жидкости прилить равный объем 10 % ТХУ и выпарить до 10 мл. Продолжить выпаривание вытяжки, удаляя избыток ТХУ 2-3-кратным промыванием смесью этилового спирта и диэтилового эфира (1:1), до объема 5 мл.

Далее полученную вытяжку разделить на две части: одна идет на определение тиамина, а вторая – рибофлавина.

2. Получение тиохрома

1. В делительные воронки объемом 50 мл налить 2,5 мл полученной вытяжки. В одну из воронок (контрольную) прилить 1,5 мл 15 % раствора NaOH, перемешать и добавить 6 мл изобутилового спирта.

2. В опытные воронки прибавить по 1,5 мл 0,04 % раствора красной кровяной соли в 15 % растворе NaOH, все содержимое перемешать и прилить 6 мл изобутилового спирта.

3. Делительные воронки закрыть пробками и сильно встряхивать в течение 1 мин. Дать смеси отстояться, затем нижний слой следует слить. Для просветления спиртового слоя прилить 1 мл этилового спирта, встряхнуть, дать отстояться и полученный прозрачный раствор слить в пробирку для последующего спектрофотометрического анализа.

3. Флюоресцентная спектроскопия растворов тиохрома и рибофлавина

1. Полученные опытные растворы тиохрома перелить в кюветы и провести измерение интенсивности флюоресценции (длина волны возбуждения λ = 250 нм). Максимум флюоресценции для тиохрома составляет λ = 495-500 нм.

Аналогично провести процедуру измерения интенсивности флюоресценции для растворов рибофлавина (длина волны возбуждения равна λ = 225 нм). Регистрировать максимум флюоресценции рибофлавина в области λ = 525-530 нм.

Учитывая, что спектральные свойства окисленных и восстановленных форм тиамина и рибофлавина изменяются, провести их сравнительный флюоресцентный анализ. Рибофлавин окисляется 4 % раствором перманганата калия, который добавляется к вытяжке по каплям до исчезновения красноватой окраски, либо концентрированной HCl в присутствии металлического цинка. Восстановление окисленных форм тиамина и рибофлавина осуществить либо гидросульфитом натрия (Na₂S₂O₄ • H₂O) либо боргидридом натрия (NaBH₄), добавляя эти восстановители в количестве 0,1–0,2 г на 1–2 мл раствора витаминов.

Результаты оформить в виде таблицы и сделать выводы.

4. Количественное определение витаминов В₁ и В₂

Для количественной оценки содержания витаминов в растительных образцах следует получить калибровочные графики зависимости интенсивности флюоресценции от концентрации. С этой целью необходимо:

1. Приготовить стандартные растворы витаминов тиамина и рибофлавина (10 мг тиамина бромида (тиамина хлорида) растворить в 100 мл 0,01 н. раствора HCl, 10 мг рибофлавина растворить в 100 мл 0,01 н. раствора NaOH).

2. Провести окисление стандартного раствора тиамина. Для этого в делительную воронку налить 1 мл рабочего раствора и прибавить 4 мл воды.

(Рабочий раствор приготовить непосредственно перед окислением. Для этого взять 1 мл стандартного раствора и довести его до 100 мл дистиллированной водой 1 мл этого рабочего раствора будет содержать 1 мкг тиамина бромида).

3. В воронку прилить щелочной раствор красной кровяной соли и провести процедуру разделения и просветления растворов, как это описано выше. Окисленный и просветленный раствор перелить в пробирки для флюориметрии.

4. Приготовить рабочий раствор рибофлавина. Для этого следует взять 1 мл стандартного раствора рибофлавина и довести его до 100 мл дистиллированной водой (1 мл этого раствора будет содержать 1 мкг рибофлавина).

5. Построить калибровочные кривые для растворов тиохрома и рибофла-вина, взяв следующие концентрации для тиамина – 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 мкг, а для рибофлавина – 0,005; 0,010; 0,020; 0,05 мкг.

По калибровочным кривым рассчитать содержание тиамина и рибофлавина (мкг/мл) в растительных образцах. Количество витаминов в исследуемом материале (мгк/г сырой массы) вычислить по формуле:

где с – содержание витамина в 1 мл вытяжки, найденное по калибро-вочной кривой; V – объем экстракта в мл; m – масса исследуемого материала в граммах.

Сделать выводы.

Контрольные вопросы

1. Содержание жиро- и водорастворимых витаминов в растительных продуктах.

2. Строение, свойства и функции витаминов в растениях.