Водные растворы L-аскорбиновой кислоты бесцветны и не поглощают в видимой области спектра, но при нейтральных значениях рН в спектре поглощения наблюдается сильный сигнал при 265 нм. Это обстоятельство было бы очень удобно использовать для непосредственного спектрофотометрического анализа, но в большинстве случаев растворы витамина С содержат вещества, также поглощающие в УФ-области, что в некоторой степени ограничивает использование этого метода. В течение ряда лет были сомнения относительно точного значения молярного коэффициента экстинкции при 265 нм; в разных работах давались значения от 7500 до 16650. Причина таких различий объясняется быстрым окислением L-аскорбиновой кислоты в нейтральных и слабокислых растворах атмосферным кислородом. До тех пор, пока спектры поглощения снимаются в строго анаэробных условиях, неизбежны низкие величины, так как поглощение продуктов окисления, при 265 нм незначительно. Сложности появляются при наличии в растворе ионов Сu⁺ и других переходных металлов, являющихся потенциальными катализаторами окисления молекулярным кислородом. Их следует удалять или связывать в комплекс путем добавления хелатирующего агента этилендиаминтетрауксусной кислоты. Положение максимума поглощения зависит от рН и в кислых растворах смещается в область 245 нм. На основании величины поглощения при этой длине волны в растворе соляной кислоты и хлорида калия определяли содержание витамина С в безалкогольных напитках и некоторых лекарственных препаратах, где незначительны примеси других веществ. [35]

Часто бывает желательно определить в одном и том же растворе содержание дегидроаскорбиновой и L-аскорбиновой кислот. Дегидроаскорбиновая кислота поглощает в УФ-области при 220 нм, но величина молярного коэффициента экстинкции значительно ниже и составляет 720. Таким образом, в этом случае чувствительность спектрофотометрического анализа почти в 20 раз меньше, чем в случае L-аскорбиновой кислоты. Позже мы увидим, что этот факт имеет далеко идущие последствия при хроматографическом разделении L-аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот. [55]

Для того чтобы преодолеть проблемы, связанные с присутствием в животных и растительных тканях веществ, поглощающих в УФ-области, проводился поиск реагентов, дающих специфические цветные реакции с L-аскорбиновой кислотой и продуктами ее окисления. Титриметрический метод с использованием дихлорфенолиндофенола, описанный выше, был адаптирован для колориметрии. Для спектрофотометрического определения можно использовать и окрашенное 2,4-динитрофенилгидразиновое производное витамина. Обнаружено, что это же самое соединение образуется с дегидроаскорбиновой и 2,3-дикетогулоновой кислотами, являющимися продуктами окисления L-аскорбиновой кислоты.

Эта реакция имеет широкое практическое применение для определения содержания дегидроаскорбиновой кислоты. Он заключается во взаимодействии раствора дегидроаскорбиновой кислоты с 2,4-динитрофенилгидразином в специфических условиях при 37°С в течение 4 ч, в результате чего образуется озазон — производное 2,3-дикетогулоновой кислоты. Эту же реакцию можно использовать и для определения содержания L-аскорбиновой кислоты, предварительно окислив ее до дегидроаскорбиновой кислоты над активированным углем (норит) раствором брома и т. п. При добавлении к озазону сильной кислоты образуется раствор красного цвета, поглощающий при 530 нм.[48]

Основу для колориметрического и спектрофотометрического методов анализа создает также ярко-синий цвет продукта реакции L-аскорбиновой кислоты с соединениями диазония.

Альтернативный подход заключается в использовании флуоресценции продукта конденсации дегидроаскорбиновой кислоты с о-фенилендиамином. Облучение образующегося хиноксалина на длине волны 350 нм приводит к его флуоресценции при 427 нм.

Обычно методика включает окисление L-аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой, и затем суммарное количество определяется спектрофлуорометрически.[44]

Электрохимический метод

Электрохимический метод предоставляют возможность высокоселективного анализа с высокой точностью и воспроизводимостью; к тому же он очень прост в исполнении. Было предложено множество методик. Например, в таблетках поливитаминов, содержащих соединения Fe²⁺, витамин С был проанализирован методом дифференциальной пульсирующей вольтамперометрии на стеклянном углеродном электроде. Однако эти методики не нашли широкого применения, так как необходима большая работа по их совершенствованию.[36]

Хроматографический метод

Хроматографический метод дает самую большую надежду на преодоление основной проблемы, связанной с присутствием в смесях, содержащих витамин С, множества мешающих анализу веществ. Как мы уже видели, пока не существует методов, позволяющих четко и непосредственно определять небольшие количества L-аскорбиновой кислоты и продуктов ее окисления в присутствии любых других соединений. Единственный удовлетворительный способ достижения специфичности заключается в хроматографическом отделении анализируемых соединений друг от друга, а также от остальных веществ.

Вплоть до относительно недавнего времени наиболее часто из хроматографических методов использовали обычно газожидкостную хроматографию (ГЖХ). Определить L-аскорбиновую кислоту непосредственно этим методом невозможно из-за ее нелетучести. Для того чтобы иметь такую возможность, была разработана длительная процедура превращения L-аскорбиновой кислоты в летучий триметилсилиловый эфир. Такой метод позволяет получать точные и воспроизводимые результаты, но из-за длительности предварительной подготовки образца он не так удобен, как разработанный недавно метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В настоящее время ВЭЖХ стала альтернативным способом быстрого определения самых разнообразных органических и неорганических соединений. Она часто находит применение в фармацевтической промышленности для анализа болеутоляющих и других препаратов. ВЭЖХ давно используется и для анализа витаминов. Однако это не решает всех проблем в случае определения витамина С. [17]

Аскорбинометрия

В аскорбинометрии рабочим раствором служит стандартный раствор аскорбиновой кислоты, которая окисляется по уравнению:

ЗС₆Н₈О₆ = ЗС₆Н₆0₆ + 6Н⁺ + 6е.

Аскорбинометрия основана на использовании аскорбиновой кислоты (АК) С₆Н₈О₆ как восстановителя. Ее применяют для прямого титрования различных окислителей. [1]

Аскорбинометрию применяют I_2,IO^-3, BrO^-3,VO^-3, CrO₄^-2, NO₃^-, MnO₄^-, Sn (IV), Ag+, Hg²⁺, H₂O₂, PbO₂, Cu²⁺ и т.д.

Окислительно-восстановительный потенциал аскорбиновой кислоты

при рН=7 и 21 °С равен +0,185 В. Аскорбинометрическое определение Fe³⁺ является одним из лучших, так как при этом не мешают нитраты и фосфаты; присутствие фторидов вызывает незначительную ошибку.

Недостатком является малая устойчивость титрованного раствора аскорбиновой кислоты при хранении.

Вариаминбляу является редокс-индикатором в кислой среде. Окисленная форма имеет синюю или красную окраску; восстановленная форма бесцветна. Переход окраски обратим. Сильные окислители постепенно разрушают индикатор.

При определении Fe³⁺ титрованием аскорбиновой кислотой индикатор добавляют незадолго до наступления точки эквивалентности, так как сильно окисляющий раствор частично разрушает индикатор. Для ускорения реакции титруемый раствор нагревают до 40 — 50 °С. Титрование с вариаминбляу дает более точные результаты, чем с роданидомаммония. [14]

Основные недостаткиаскорбинометрии следующие: аскорбиновая кислота подвержена действию энзим и ультрафиолетовых лучей, каталитически ускоряющих ее разложение. Поэтому для приготовления стандартных растворов рекомендуется применять особо чистые образцы аскорбиновой кислоты и хранить их на холоде в темноте в склянках из оранжевого стекла. Для стабилизации растворов аскорбиновой кислоты рекомендуется добавлять к ним этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и муравьиную кислоту, благодаря чему ее стандартные растворы сохраняются дольше.

В химическом анализе, использующем редокс-реакции, сложился набор веществ, которые наиболее широко используют в качестве титрантов. Поэтому в руководствах по аналитической химии для реакций окисления отдельно рассматриваются перманганатометрия, бихроматометрия, цериметрия, броматометрия, а для реакций восстановления - хроматометрия, титанометрия, аскорбинометрия. [27]