Поместить в пробирку по одной капли метиленового синего, гидрокарбоната натрия и натурального сока, нагреть до кипения, обесцвечивание раствора свидетельствует о наличии аскорбиновой кислоты в растворе. [14]

Определение аскорбиновой кислоты методом титрования реактивом Тильманса.

Принцип метода основан на окислительно - восстановительной реакции между аскорбиновой кислотой и индикатором 2,6-дихлорфенолиндофенолом (реактив Тильманса).

Реактивы: 0,001 н. раствор краски Тильманса (1 мл соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты); 2% раствор хлористоводородной кислоты. Для приготовления этого раствора взвешивают 0,2 г соли и растворяют в 600 мл дистиллированной воды при энергичном взбалтывании (рекомендуется оставить на 12 часов), затем фильтруют через складчатый фильтр, доводят объем водой до 1 л и хранят в темном месте. Срок годности реактива не более 7 суток. После приготовления краски Тильманса устанавливают ее титр по соли Мора. Для этого в каноническую колбу наливают 10 мл 0,001 н. раствора краски Тильманса, титр которого хотят установить, прибавляют 5 мл насыщенного раствора оксалата аммония (7 г на 100 мг воды) и титруют 0,01н. раствором соли Мора до перехода синей окраски в соломенно-желтую. Для получения 0,01 н. раствора соли Мора берут навеску 3,92 г соли и растворяют в 0,01% растворе серной кислоты (0,56 мл серной кислоты с относительной плотностью 1,84 разбавляют дистиллированной водой в колбе до объема 1л). Раствор хранят в склянке из темного стекла.

Для установления титра приготовленного раствора соли Мора в каноническую колбу наливают 10 мл данного раствора, прибавляют 1,5 мл серной кислоты, а разбавлении 1:2 и титруют 0,01н. раствором перманганата калия (0,316 г на 1 л дистиллированной воды) до появления устойчивой окраски.

Титр раствора перманганата калия устанавливают по свежеприготовленному точному раствору оксалата аммония, для приготовления которого растворяют 0,062 г этой соли в 100 мл дважды дистиллированной воды. Для установления титра к 10 мл раствора оксалата аммония прибавляют 2,5 мл серной кислоты в разбавлении 1:2 и титруют раствором перманганата калия на водяной бане при температуре, близкой к кипению, до появления слабо розовой окраски.

Для исследования продуктов питания на содержание витамина С берут необходимые навески: 5 мл молока, 10 мл настоя шиповника,1-50 мл соков и экстрактов, 1-2 г драже и таблетки, 10-50 г свежих растительных продуктов и т.д. Для анализа жидкие и пастообразные продукты тщательно перемешивают (растирают в фарфоровой ступке) с небольшим количеством 2% раствора хлористоводородной кислоты (всего берут 50 мл кислоты). После растирания в ступку добавляют оставшуюся часть 2% раствора хлористоводородной кислоты. Для полного извлечения аскорбиновой кислоты смесь оставляют в ступке на 10 мин, затем фильтруют через четыре слоя марли, вложенной в воронку.

Для определения аскорбиновой кислоты от 1 до 10 мл фильтрата помещали в колбу вместимостью 100 мл, добавляли 1 мл 2% раствора хлористоводородной кислоты и доводят объем жидкости до 15 мл. После этого содержимое колбы титруют 0,001 н. раствором краски Тильманса до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. [53]

Определение аскорбиновой кислоты методом йодометрического титрования

Около 0,5 мл исследуемого раствора наливаем в мерную колбу емкостью 50 мл, доводим водой до метки и тщательно перемешиваем.

Берем навеску первичного стандарта ( первичным стандартом является раствор йодата калия (KIO₃). Рассчитываем массу так, чтобы при растворении в 200,00 мл воды у нас получился ~0,1000 н. раствор.

Растворяем йодат калия в 200,00 мл воды.

Выполнение определения: берем аликвоту раствора в 10,00 мл , прибавляем 0,50 мл 1% раствора йодида калия, 2,00 мл раствора крахмала, 1,00 мл 2% раствора соляной кислоты и титруем 0,1000 н. раствором йодата калия до появления стойкого слабо-синего окрашивания. [3]

Определение аскорбиновой кислоты методом броматометрического титрования

Готовят 500 мл 0,1 н. раствора бромата калия по навеске. Берут 20 мл сока, добавляют 20 мл соляной кислоты(1:1) и доводят до 100 мл в мерной колбе водой. К полученному раствору прибавляют 1-2 мл крахмала и 2-3 капли 0,1 н. раствора иодида калия и титруют стандартным раствором бромата калия до появления слабой синей окраски, устойчивой в течение 20 секунд. [20]

Алкалиметрия

Кислотные свойства кислоты аскорбиновой выражены в доста­точной степени, что позволяет количественно определять лекар­ственное вещество алкалиметрически. Кислота аскорбиновая тит­руется стандартным 0,1 М раствором натрия гидроксида как одноосновная кислота по енольному гидроксилу в 3-м положении.

Выраженные восстановительные свойства кислоты аскорбино­вой лежат в основе нескольких методик количественного опреде­ления данного лекарственного вещества (йодатометрия, йодометрия, йодхлорметрия). [1]

Йодометрия

Кислота аскорбиновая окисляется титрованным раствором йода в нейтральной, слабокислой или слабощелочной средах до кислоты дегидроаскорбиновой.

Возможны и другие методики, например титрование натрия 2,6-дихлорфенолиндофенолятом.

Кислота аскорбиновая используется в виде порошков, таблеток и растворов для инъекций. Поскольку в растворах она легко окис­ляется, инъекционные растворы готовят на воде, насыщенной СО₂, с добавлением стабилизаторов-антиоксидантов (Na₂SО₃, Na₂S₂О₅). В раствор для инъекций добавляют натрия гидрокарбонат, так как препарат имеет кислую реакцию среды, раздражающую ткани.

При йодатометрическом методе количественного определения кислоты аскорбиновой в инъекционном растворе следует учиты­вать наличие антиоксидантов-стабилизаторов, которые будут реа­гировать с титрантом - КIO₃. Поэтому вначале к раствору добавля­ют раствор формальдегида, связывающий антиоксиданты. [20]

1.4.7.Смешанолигандноекомплексообразование меди (II) с фенантролином, аскорбиновой и никотиновой кислотой

Жизненно важные металлы, такие как железо, медь, цинк, марганец, молибден, кобальт и другие, образуют комплексные соединения с биолигандами, в качестве которых выступают аминокислоты, витамины, белки, гормоны. Органические лиганды могут одновременно входить в координационную сферу металла и оказывать взаимное влияние. Изучение смешанолигандного комплексообразования помогает выяснить характер этого влияния. [24]

В качестве комплексообразователя авторами выбран катион Cu²⁺ , а в качестве лигандов — витамины и слабые органические основания. Комплексы металлов с аскорбиновой кислотой (витамин С) играют важную роль в процессах окисления аскорбиновой кислоты в живых клетках.

Никотиновая кислота (пиридин-3-карбоновая кислота), известная как витамин РР, тоже является комплексообразующим агентом благодаря наличию карбоксильной группы и гетероциклического атома азота в ее молекуле.

Фенантролин — органическое основание — в процессах комплексообразования выступает в качестве лиганда, способного участвовать в образовании d- и р-связей и облегчающего вхождение в координационную сферу металла второго лиганда.[43]

Методами pH-потенциометрии, спектро- и фотометрии (в сульфатной и нитратной средах) установлено смешаннолигандное комплексообразование (СЛК) в системах: медь (II)–аскорбиновая кислота–фенантролин, медь(II)–аскорбиновая кислота–никотиновая кислота. Определены состав и устойчивость однолигандного комплекса [CuHAsc]⁺, [CuHAscPhen]⁺, [CuHAscNic].

Изучению смешанолигандного комплексообразования предшествовало исследование однолигандных комплексов в системах: медь (II)–аскорбиновая кислота, медь (II)–никотиновая кислота [25] и медь (II)–фенантролин.

Взаимодействие в системе Сu²⁺–H₂Asc представляет собой сложный химический процесс, состоящий из нескольких стадий и протекающий в соответствии со схемой:

Cu²⁺ + n Lz^–←→ [CuLn]² + z→ Cu⁺ + продукты окисления → Сu_(тв) (1)

где Lz^– — анион аскорбиновой кислоты.

Стадия окислительно-восстановительного распада образующегося промежуточного протонированного аскорбатного комплекса меди (II) состава 1 : 1 является реакцией первого порядка и лимитирующей. Однолигандный аскорбатный комплекс характеризуется константой устойчивости, логарифм которой равен 2.09 ± 0.06.

Измерение оптической плотности в системе CuSO₄–Phen при различных рН показывает, что 100 %-ный выход фенантролинатного комплекса меди (II) состава 1 : 1 достигается при pН ≈ 3 и характеризуется коэффициентом молярного погашения = 28.5 (λэф = 670 Нм).

Комплекс [СuРhen]²⁺не подвергается окислительно-восстановительному распаду, о чем свидетельствует постоянство окраски в течение длительного времени. По данным Инцеди [12] логарифм константы устойчивости комплекса [CuPhen]²⁺составляет 9.25 (I = 0.1).

Состав комплексов в системах Cu²⁺–H₂Asc, Cu²⁺–H₂Asc–HNic и Cu²⁺–H₂Asc–Phen определяли при pН ≈ 3.1 и ионной силе I = 0.2. Состав однолигандных комплексов устанавливали методом изомолярных серий, смешанолигандных — скорбатникотинатного [CuHAscNic] и аскорбатфенантролинатного [CuHAscPhen]³⁺ комплексов — по методу насыщения из графика зависимости ∆D от CL/CCuHAsc, построенному по полученным экспериментальным данным.

В системах CuSO₄–H₂Asc–Phen и CuSO₄–H₂Asc–HNic образуются комплексы состава 1:1:1:

Cu²⁺ + HАsc^– + Phen [CuHAscPhen] ⁺ (2)

Cu²⁺ + HАsc^–+ Nic^– [CuHAscNic] (3)

Изучена устойчивость [CuHAscPhen]⁺, [CuHAscNic] в водных растворах с ионной силой I = 0.2 при pH от ≈ 3 до 6, рассчитанных константы устойчивости. Найдены эффективные константы скорости окислительно-восстановительного распада комплексов [CuHAsc]⁺, [CuHAscPhen]⁺, [CuHAscNic] в сульфатной и нитратной средах. Электронные спектры поглощения (ЭСП) в видимой области сняты на спектрофотометре UVIKON 943 при комнатной температуре и при температуре 2–3 ºС. В ЭСП двойных и тройных систем по сравнению с водным раствором CuSO₄ наблюдается смещение максимума полосы поглощения в коротковолновую область, что может свидетельствовать о комплексообразовании в этих растворах. [8]

1.5. Биологические методы определения аскорбиновой кислоты

Сегодня биологические методы представляют главным образом исторический интерес. Но на самом деле их преимущество заключается в том, что они основаны на определении конкретного профилактического и лечебного свойства, а именно антискорбутной активности, присущей и дегидроаскорбиновой кислоте. Биологические методы требуют больших затрат времени и средств и дают широкий разброс результатов, которые не всегда надежны. Для проведения биоанализа используют морских свинок, так как крысы синтезируют собственный витамин С. Животных выдерживают на искусственном рационе с добавлением различных количеств витамина, затем забивают, а их зубы подвергают гистологическому анализу. В результате устанавливают степень защиты от цинги в зависимости от количеств аскорбиновой кислоты, поступающей с пищей. Антискорбутная активность 0,05 мг аскорбиновой кислоты принята в качестве международной единицы для измерения содержания витамина С. [9]

1.6. Физико-химические методы определения аскорбиновой кислоты