Императорским указом от 10 ноября 1764 года гетманское правление было опять отменено, Генеральная войсковая канцелярия упразднена и восстановлена на прежних правах Малороссийская коллегия. Президентом коллегии был назначен главнокомандующий русскими войсками на Украине, он же генерал-губернатор края (в чине генерал-аншефа П.А. Румянцев). В присутствие этой второй Малороссийской коллегии входили 8 членов: 4 русских из генералов и штаб-офицеров местных гарнизонов и 4 украинца из казачьей генеральной старшины. Имелся и прокурор (русский) в чине подполковника.

С 1765 по 1769 годы проведена ревизия земель, перепись населения, предприятий, скота. Эта ревизия была настолько всеохватывающей, что получила название «Генеральной описи Малороссии». Уже в первые годы своей деятельности в Малой Руси П. Румянцев провел крупные мероприятия по унификации местных органов власти и порядков с общероссийскими учреждениями и законодательством, увеличению поступлений в государственную казну. Руководимая им Малороссийская коллегия незаметно поглотила Генеральную войсковую канцелярию, подчинила другие органы Гетманщины своим департаментам. С 1765 г. была заведена регулярная почтовая связь, ликвидированы слободские казацкие полки (их было пять) и вместо них созданы регулярные гусарские полки; Натуральные поборы и повинности на содержание российских войск («консистентские дачки») были заменены денежной податью в размере 1 рубля 2 копеек со двора. Преобразования П.Румянцева прервала война с Турцией 1768 - 1774 гг.

При распространении в 1781 году на Малороссию общего положения о губерниях Малороссийская коллегия временно была сохранена, с формулировкой «для окончания нерешённых дел». Окончательное упразднение её последовало в 1786 году.

В 1734 более 30 тыс. запорожцев с территорий подвластных крымскому хану Каменской и Олешковской Сечей вернулись на Запорожье и в 7 км от бывшей Чертомлицкой (Старой) Сечи заложили Новую Сечь. Во времена Новой Сечи чрезвычайно оживилась хозяйственная деятельность запорожцев. Поскольку крымские татары после завоевания Крыма русскими войсками больше не представляли военной угрозы для Российской империи, Екатерина II решила, что сохранение на границах Крымского ханства Запорожской Сечи потеряло всякий смысл. Были и другие причины, подталкивавшие царизм к ликвидации запорожской вольницы. Так как во владениях запорожцев крепостное право отсутствовало, сюда постоянно стекались беглые крепостные крестьяне; находили здесь приют и бунтари, и участники восстания 1773—1774 гᴦ. под предводительством Емельяна Пугачева. Экономическим факторам, ускорившим разгон Сечи, следует отнести стремление царских властей овладеть богатыми землями Юга Малой Руси, которые запорожцы традиционно считали своей собственностью. В то же время, между низовыми казаками и царским правительством, приступившим к этому времени к активному освоению земель Новороссии, временами возникали конфликты. Так, казаки неоднократно громили колонии сербских поселенцев в Таврии из-за земельных споров. 4 июня, российские войска под командованием генерал-поручика П. Текели, не встретив ни малейшего сопротивления, российские войска подошли к стенам сечевой крепости. Сняв часовых и захватив всю артиллерию, они окружили казацкий поселок, затем гавань на реке Подпольной и овладели казацкими челнами. Понимая, что сопротивляться бессмысленно, запорожцы согласились капитулировать. На следующий день из Сечевого хранилища вывезли боеприпасы, клейноды, знамена, материальные ценности и архив запорожской войсковой канцелярии. 29 июня 1775 ᴦ. вышел указ Сената, в котором пояснялись причины ликвидации Запорожской Сечи и содержалось разрешение выдать пособия лояльно настроенным старшине и казакам. Часть запорожской старшины не только сохранила свои угодья, но получила также дополнительные участки земли и офицерские чины. При этом кошевой атаман Петр Калнышевский, судья Павел Головатый и писарь Иван Глоба были судимы и сосланы в отдаленные монастыри: первый — в Соловецкий, второй — в Тобольский, третий — в Туруханский. Последний кошевой атаман Запорожской Сечи отсидел на Соловках четверть века, был помилован царем Александром I в 1801 ᴦ. и скончался там же, в Соловецком монастыре, в 1803 ᴦ. в возрасте 113 лет. Окончательно судьба запорожцев была решена 3 августа 1775 года подписанием российской императрицей Екатериной II манифеста «Об уничтожении Запорожской Сечи и о причислении оной к Новороссийской губернии».