В оттаянной сперме по способу БелНИИЖ
Объекты исследования, материалы и оборудование: замороженная в соломинах сперма быка; 2,9%-ный раствор натрия цитрата в ампулах; 7%-ный раствор глюкозы или 9%-ный раствор лактозы; микроскопы БИОЛАМ (МБИ-3 или МБИ-4) с осветителями ОИ-19 (ОИ-35, МКИ-11) и конденсор ОИ-10 или фазово-контрастный микроскоп; биотермостат, обогревательные столики, дозаторы пипеточные и наконечники к ним, глазные палочки; предметные и покровные стекла; фильтровальная бумага, марлевые салфетки; термостат.
Оттаянную в соломинке сперму выливают в ампулу с 2,9%-ным раствором натрия цитрата (1 мл, t = 38°C), содержимое осторожно смешивают. В небольшой (5–10 мл) флакон наливают 1 мл 7%-ного раствора глюкозы медицинской безводной или 9%-ного раствора лактозы и добавляют 0,2 мл разбавленной после оттаивания спермы; температура спермы и раствора – 18–20°C. Небольшую каплю вторично разбавленной спермы наносят стеклянной глазной палочкой (дозатором пипеточным) на подогретое (t = 38°C) предметное стекло, накрывают покровным стеклом, помещают на обогревательный столик микроскопа и просматривают при увеличении 600–800х. Подсчитывают всех сперматозоидов в пяти полях зрения, причем в каждом из них сначала учитывают подвижных. Подсчитывают общее количество просмотренных сперматозоидов и вычисляют процент подвижных.
Для лучшей видимости сперматозоидов рекомендуется использовать конденсор ОИ-10.
Оценка качества спермы птиц
Для оценки спермы определяют ее внешние свойства (цвет, консистенцию), объем, густоту, подвижность и концентрацию сперматозоидов. Объем эякулята определяют по верхнему мениску градуированного спермоприемника или градуированной пипеткой. Цвет и густоту спермы определяют визуально.
У индюка густая сперма имеет консистенцию сметаны, в 1 мл содержит 8 млрд. сперматозоидов или более. Она почти не стекает по желобку копуляторного органа, в массе своей имеет выпуклую форму. Средняя сперма с консистенцией густых сливок, медленно стекает по желобку толстым слоем, в 1 мл – 6–8 млрд. клеток. Редкая сперма с консистенцией густого молока или редких сливок тонким слоем стекает быстро по желобку, в 1 мл содержит 3–5 млрд. сперматозоидов.
Подвижность сперматозоидов оценивают под микроскопом, нередко в смешанных эякулятах (от 7–10 самцов), а концентрацию – путем подсчета в счетной камере и с помощью ФЭК или спектрофотометра. Вследствие высокой концентрации оценка подвижности сперматозоидов по 10-балльной системе затруднена.
Н. Канарейкин (1975) использовал 6-балльную систему оценки качества спермы индюков:
1 балл – движение сперматозоидов настолько энергично, что едва можно различить отдельные клетки;
2 балла – движение сперматозоидов энергичное, но можно различить отдельные клетки;
3 балла – движение спокойное поступательное;
4 балла – слабое (ленивое) замирающее движение;
5 баллов – слабое колебательное движение;
6 баллов – сперматозоиды неподвижные.
Для осеменения рекомендует использовать сперму индюков с оценкой 1 и 2 балла.
Контрольные вопросы
1. В какие сроки должна быть проведена оценка полученной спермы? При какой температуре хранят ее до разбавления?
2. От чего зависят внешние свойства спермы – цвет и консистенция? Каковы характерные цвет и консистенция спермы хорошего качества у различных производителей животных и птиц?
3. Чем может быть загрязнена сперма? Что делают со спермой, загрязненной или с измененными цветом, консистенцией?
4. Можно ли ограничиться оценкой внешних свойств спермы?
5. Как влияет понижение температуры на подвижность сперматозоидов в свежеполученной сперме? При какой температуре следует определять их подвижность?
6. Влияют ли толщина мазка и процент подвижных сперматозоидов на результаты оценки спермы при микроскопическом исследовании? Как оценивают подвижность сперматозоидов в различных странах?
7. С какой целью определяют концентрацию сперматозоидов в сперме?
8. Какой метод наиболее часто используется для определения концентрации сперматозоидов? Какие факторы влияют на этот показатель?
9. Какие наиболее типичные отклонения встречаются в морфологии сперматозоидов? Как их классифицируют?
10. Какие факторы могут вызвать появление в сперме повышенного числа ненормальных сперматозоидов?
11. Какие аномалии сперматозоидов обусловлены генетически и какие связаны с факторами внешней среды? Какие аномалии наиболее сильно влияют на плодовитость производителя?
12. Какие тесты можно использовать для оценки интенсивности метаболических процессов в сперме? Их сущность?
13. Существует ли корреляционная связь между концентрацией сперматозоидов в сперме и индексом фруктолиза, величиной рН, скоростью обесцвечивания метиленовой сини?
14. Как изменяется рН свежеполученной спермы при хранении при комнатной температуре?
15. Каковы стандартные показатели качества спермы быков, баранов, хряков, жеребцов, кроликов и индюков?
16. Какие показатели качества спермы подвержены наибольшим изменениям?
17. Возможно ли улучшение качества спермы после ее получения?
18. Какие методы оценки качества спермы позволяют наиболее объективно и точно прогнозировать ее оплодотворяющую способность?
19. Результаты какой оценки спермы: до замораживания (охлаждения) или после оттаивания более важны при искусственном осеменении?
20. Как определить состояние акросом у подвижных сперматозоидов? Сохраняют ли сперматозоиды способность к оплодотворению при повреждении акросомы?
21. Какие факторы влияют на результаты оценки качества спермы?
22. Почему необходимо постоянно регистрировать показатели качества эякулятов у одного и того же производителя?
Тема 6. Изучение влияния на сперматозоидов
физических и химических факторов
Цель занятия: изучить действие физических и химических факторов на подвижность и выживаемость сперматозоидов.
Объекты исследования, материалы и оборудование: животные – бык, корова (чучело) или самец и самка другого вида; оборудование, материалы и инструменты для получения спермы (соответствующего вида животных); термостат для микроскопа; микроскопы с осветителями, микроскоп МБИ-11 (БИОЛАМ - М) с телевизионной камерой; обогревательные столики, металлическая пластина; дозаторы пипеточные и наконечники к ним, пипетки глазные, палочки стеклянные; предметные и покровные стекла; марлевые салфетки, полотенца; растворы натрия хлорида: физиологический, 0,5%-ный и 3%-ный; 1%-ный раствор молочной кислоты; лед, поваренная соль; ртутный термометр; прибор для измерения рН, раствор универсального индикатора (или бумажные индикаторные полоски).
Методические указания. Занятия проводят в ветеринарной клинике и лаборатории кафедры или в учебном пункте. Сначала преподаватель объясняет студентам действие на сперматозоидов некоторых факторов, знакомит их с методами контроля физических и химических свойств сред для разбавления спермы. Затем студенты готовят искусственную вагину для получения спермы (от быка или самца другого вида животных), получают сперму; одновременно приготавливают и среду для разбавления спермы. Разделившись на группы (по 2 человека за столом) изучают действие температуры, растворов с различным осмотическим давлением, молочной кислоты на подвижность и выживаемость сперматозоидов. В конце занятия преподаватель демонстрирует студентам определение осмотического давления среды для разбавления спермы методом криоскопии и рН среды потенциометрическим методом.
Изучение действия высокой и низкой температуры. В выделенной сперме, имеющей температуру 38,5°С, сперматозоиды проявляют высокую метаболическую активность и подвижность. При повышении температуры до 41–43°С подвижность их возрастает, а скорость гликолиза в сперме быка достигает максимума при 43–46°С. При температуре около 50°С происходит денатурация белка и другие необратимые изменения, которые приводят к гибели клеток. Продолжительность жизни сперматозоидов при температуре выше 20°С ограничена несколькими часами. Это связано с быстрым расходованием ими ряда химических соединений и неспособностью восстанавливать или поглощать их из внешней среды.
При понижении температуры интенсивность движения сперматозоидов уменьшается, а при температуре 7°С они приостанавливают свои движения. Интенсивность метаболических процессов снижается, но полностью они не прекращаются и протекают еще на достаточно высоком уровне (состояние анабиоза). Продолжительность сохранения оплодотворяющей способности сперматозоидов при таких температурах (0–5°С) увеличивается до нескольких дней.
После подогревания охлажденной спермы подвижность сперматозоидов восстанавливается. Однако это наблюдается в том случае, если охлаждалась сперма медленно. В других случаях охлаждение может вызвать у сперматозоидов необратимые изменения и их гибель. Это происходит вследствие "холодового удара" (температурного шока) в результате резкого охлаждения. Температурный шок наблюдается при температурах выше 0°С, но возможен и при отрицательных температурах, когда сохраняется жидкая фаза и имеются условия для протекания осмотических процессов.
Наиболее чувствительны к быстрому снижению температуры сперматозоиды хряка. В неразбавленной сперме быка температурный шок у сперматозоидов возможен при температуре ниже 24°С. В разбавленной желточно-цитратной или молочной средой сперме действие температурного шока может проявиться при резком снижении температуры ниже 16°С. В связи с этим в практике должны обращать внимание на скорость охлаждения разбавленной спермы до момента замораживания.
Для изучения действия различных температур на сперматозоидов из полученной спермы готовят три мазка; предметные стекла предварительно подогревают до температуры спермы. Один мазок помещают поочередно на два подготовленные обогревательные столики с температурой 38°С и 43–45°С и определяют под микроскопом подвижность сперматозоидов; затем мазок снимают с обогревательного столика и оставляют при комнатной температуре на 5–7 мин. Второй мазок помещают на лед и охлаждают несколько минут. После охлаждения вначале определяют под микроскопом состояние сперматозоидов при комнатной температуре, а затем кладут на обогревательный столик и определяют их подвижность при температуре 38°С.
Также поступают и с уже исследованным первым мазком: просматривают его при комнатной температуре, а потом – после подогревания до 38°С.
При комнатной температуре в первом мазке сперматозоиды будут проявлять заметную подвижность, а после подогревания исходная подвижность восстановится. Во втором мазке при комнатной температуре только отдельные сперматозоиды проявят слабые движения, а после подогревания немногие из них восстановят подвижность; большинство же клеток будут неподвижными – они погибнут вследствие температурного шока.
В третьем мазке определяют подвижность сперматозоидов сначала при температуре 38°С, а затем мазок помещают на подогретую до 55°С пластину и оставляют на ней несколько минут. После этого опять определяют подвижность сперматозоидов. Все клетки погибнут и не проявят подвижность.
Изучение действия растворов (сред) с различным осмотическим давлением. Осмотическое давление спермы определяется количеством растворенных в плазме веществ: минеральных и органических. Выражается осмотическое давление в атмосферах; колеблется в пределах 6,7–8,7 атм. Определяется этот показатель на основании величины депрессии, т.е. точки замерзания, которая для спермы животных равна примерно минус 0,6°С, и исходя из правила, что раствор, содержащий в 1 л грамм-молекулу не электролита, дает депрессию минус 1,86°С и имеет осмотическое давление 22,4 атм. Для получения равных по осмотическому давлению сперме растворов (изотонических) необходимо брать 1/3 грамм-молекулы не электролита на 1 л дистиллированной воды. Если берется электролит, то количество вещества уменьшается во столько раз, на сколько ионов диссоциирует его молекула. Например, для приготовления изотонического раствора натрия хлорида необходимо взять не одну треть, а одну шестую грамм-молекулы, т.е. 58,5:6.
Если поместить сперматозоидов в гипотонический раствор или дистиллированную воду, то они быстро погибнут вследствие повышения внутреннего давления. Под влиянием гипотонического раствора хвостики сперматозоидов набухают и закручиваются. В гипертоническом растворе сперматозоиды погибают от обезвоживания. Они сморщиваются, а хвостики их приобретают зигзаговидную форму. Особенно губительно для сперматозоидов быстрое изменение осмотического давления. В изотоническом растворе (физиологический раствор, среда Дюльбекко и др.) сперматозоиды будут проявлять высокую подвижность в течение достаточно продолжительного периода времени.
Для изучения действия на сперматозоидов растворов с различной концентрацией солей из полученной спермы (или оттаянной) готовят три мазка. Для этого на подогретое предметное стекло наносят дозатором пипеточным или глазной пипеткой три капельки спермы и рядом с каждой из них капельку одного из трех растворов натрия хлорида: изотонического, 0,5%-ного и 3%-ного. Каждую пару капелек (сперму и раствор) осторожно накрывают покровным стеклом так, чтобы они соединились под покровным стеклом, но граница между ними четко просматривалась. Все три мазка исследуют под микроскопом и наблюдают за состоянием сперматозоидов на границе раствора и спермы, а также в растворе и в сперме.
Изучение действия рН среды. Если сперму быка или барана хранить при комнатной температуре, то в результате гликолиза накапливается молочная кислота, буферные свойства спермы ослабевают, а затем показатель рН начинает снижаться. Подвижность сперматозоидов замедляется, а затем приостанавливается полностью вследствие наступления состояния анабиоза. Тормозится подвижность сперматозоидов и в гипертонических солевых растворах. При повышении рН и температуры среды, или при добавлении воды в гипертонический раствор сперматозоиды восстанавливают свою подвижность.
Для перевода клеток в активное состояние температура должна быть тем выше, чем ниже рН. Так, в слабощелочной среде (рН 7,6) сперматозоиды двигаются при температуре 15–20°С, а при рН 6,0 движение их проявляется только при 35–40°С. При рН 4,5 одного повышения температуры уже недостаточно, чтобы вывести сперматозоидов из анабиоза, требуется одновременное повышение температуры и подщелачивание среды. Длительное воздействие на сперматозоидов среды с более низким значением рН приводит к их гибели. Слабые органические кислоты проявляют губительное действие и при рН выше 5,0. Так, при температуре 4°С молочная кислота может необратимо иммобилизовать сперматозоидов уже при рН 6,0.
Сразу же после получения из неразбавленной спермы готовят несколько мазков. На одном предметном стекле помещают две капельки спермы. Рядом с одной капелькой помещают капельку 1%-ного раствора молочной кислоты и обе капельки накрывают покровным стеклышком. На другую капельку спермы наносят такую же капельку кислоты и обе капли смешивают стеклянной палочкой. При помощи универсального индикатора определяют рН смеси: оранжевая или желто-оранжевая окраска капли свидетельствует о том, что рН ниже 6,0. После этого просматривают под микроскопом мазок на границе раствора кислоты и спермы и наблюдают за гибелью сперматозоидов после попадания их в раствор кислоты.
На другое предметное стекло также наносят две капли спермы. Рядом с одной помещают капельку подкисленного физиологического раствора (к 10 мл 1%-ного раствора натрия хлорида приливают 2 мл 1%-ного раствора молочной кислоты) и обе капли накрывают покровным стеклом. На другую капельку спермы наносят каплю подкисленного физиологического раствора и обе капельки смешивают. При помощи индикатора определяют рН смеси – показатель рН около 6,0. Мазок исследуют под микроскопом сначала при температуре 20–25°С, а затем – на обогревательном столике при 38°С. При комнатной температуре сперматозоиды будут неподвижны, но после подогревания некоторые из них могут возобновлять движения.
На третье предметное стекло также наносят две капли спермы. Рядом с ними помещают по капельке подкисленного физиологического раствора и по 1–2 капельки натрия цитрата. Первые три (четыре) капельки смешивают, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом, а другие три (четыре) капельки после смешивания используют для определения рН смеси. После добавления натрия цитрата рН смеси приобретает щелочную реакцию (желто-зеленая или зеленая окраска). Подвижность сперматозоидов в такой смеси может быть достаточно активной.
Изучение действия антисептических растворов. Пункты (лаборатории) по искусственному осеменению нередко расположены вблизи ветеринарных аптек, где могут храниться различные дезинфицирующие вещества. На сперматозоидов они действуют губительно. Это относится и к моющим средствам: даже следы мыла на руках или на посуде проявляют на половые клетки губительное действие.
В процессе занятия целесообразно изучить действие на сперматозоидов ряда дезинфицирующих средств. Из неразбавленной или разбавленной спермы готовят несколько мазков. На одно предметное стекло наносят 2–3 капельки спермы. Рядом с каждой капелькой ее помещают по одной капельке какого-либо раствора: марганцовокислого калия 1:2000, лизола 1%-ного, спирта 70%-ного, йода 5%-ного, мыльной воды (и т.д.) и каждую пару капелек накрывают покровным стеклышком. Все три мазка исследуют под микроскопом и наблюдают за состоянием сперматозоидов на границе раствора и спермы, а также в растворе и в сперме.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Тема 4. Получение спермы от производителей …………………………………… 3
4.1. Получение спермы от производителей в искусственную вагину …...…... 4
4.2. Использование других методов для получения спермы
от производителей ……………………………...…………………………… 14
4.3. Получение спермы у самцов птиц ……………………………………..…… 17
Тема 5. Оценка качества спермы …….……………………………………..………… 20
5.1. Обязательные методы оценки качества спермы ……...………………… 21
5.2. Дополнительные методы оценки качества спермы ………………..……. 31
Тема 6. Изучение влияния на сперматозоидов физических
и химических факторов . ……………………………………………………... 44
У ч е б н о - м е т о д и ч е с к о е и з д а н и е
Григорий Федорович Медведев
Николай Иванович Гавриченко
Игорь Анатольевич Долин
БИОТЕХНИКА РАЗМНОЖЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
Ч а с т ь 2. ПОЛУЧЕНИЕ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ САМЦОВ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ
Методические указания к лабораторным занятиям
Редактор Т.П. Рябцева
Техн. редактор Н. К. Шапрунова
Корректор А.М. Павлова
ЛИ №348 от 09.06.2004. Подписано в печать 08.08.2008
Формат 60 х 84 1/16. Бумага для множительных аппаратов.
Печать ризографическая. Гарнитура «Таймс».
Усл. печ.л. 3,02. Уч.-изд. л. 2,84. .
Тираж 100 экз. Заказ 273/08. Цена 3940 руб.
Редакционно-издательский отдел БГСХА
213407, г. Горки Могилевской обл., ул. Студенческая, 2
Отпечатано в отделе издания учебно-методической литературы, ризографии
и художественно-оформительской деятельности БГСХА
г. Горки, ул. Мичурина, 5
Дата: 2018-11-18, просмотров: 506.
