Электрофотоколориметрический метод основан на способности спермы ослаблять проходящий через нее пучок света пропорционально концентрации сперматозоидов. Величина ослабления света регистрируется фотоэлементами прибора ФЭК, позволяющего определить оптическую плотность спермы. Оптическая плотность различных образцов спермы при стандартном разбавлении повышается прямо пропорционально концентрации половых клеток.

Сперму необходимо исследовать сразу же после ее получения. Для этого из свежеполученного эякулята отбирают пробу спермы и разбавляют 2,9%-ным раствором цитрата натрия.

Сперму быка разбавляют в 100 раз, взяв 0,1 мл спермы и 10 мл цитрата натрия.

Сперму барана разбавляют в 400 раз, взяв 0,025 мл спермы и 10 мл цитрата натрия.

Сперму хряка разбавляют в 30 раз, взяв 0,4 мл спермы и 12 мл цитрата натрия.

Разбавление производят во флаконе емкостью 10 – 20 мл. Необходимо до получения спермы приготовить столько флаконов, сколько планируется получить эякулятов, и в них заранее внести раствор натрия цитрата. В современных приборах предусмотрен автоматический отбор пробы спермы и разбавление ее в кювете для исследования.

При взятии проб спермы необходимо стремиться к высокой точности. Пробы следует отбирать только микропипетками или пипеточными дозаторами из середины свежеполученных эякулятов, не допуская попадания пены или вазелина. Перед внесением пробы спермы в раствор микропипетки следует вытирать снаружи чистой марлевой салфеткой для удаления излишней спермы. Температура 2,9%-ного раствора цитрата натрия должна быть в пределах +20–25 ^оС.

Для исследования необходимы две кюветы с рабочей толщиной 10 мм. Одну их них наполняют (до метки) спермой, разбавленной 2,9%-ным цитратом натрия, вторую – только 2,9%-ным цитратом натрия.

Кюветы ставят в кюветодержатель прибора и сначала располагают на пути пучка света (с длиной волны около 550 нанометров, красный светофильтр) кювету с цитратом натрия (без спермы). Стрелка гальванометра при этом смещается. Ручками грубой и тонкой настройки ее устанавливают на "0". Затем перемещают кюветодержатель, располагая на пути пучка света кювету со спермой. В результате стрелка гальванометра укажет величину, соответствующую оптической плотности спермы.

Далее оптическую плотность спермы необходимо пересчитать в концентрацию. Для этого необходимо тщательно определить концентрацию сперматозоидов в сперме в 10–20 пробах эякулятов в счетной камере Горяева и одновременно исследовать их на приборе. Подсчет концентрации сперматозоидов в сперме в камере Горяева должен проводиться четырехкратно по каждому эякуляту путем заправки сразу двух меланжеров и двукратного подсчета в камере с каждого меланжера. При этом берется среднеарифметический результат из всех четырех подсчетов. Подсчеты одного и того же эякулята не должны отличаться между собой более чем на 10%. Нужно стремиться, чтобы отобранные для выведения калибровочной кривой эякуляты были по возможности различной концентрации – от редких до самых густых.

Определив концентрацию отобранных эякулятов и исследовав их на приборе, строят калибровочную кривую. Для этого откладывают в определенном масштабе (лучше на миллиметровой бумаге) по горизонтальной оси известные показатели концентрации, а по вертикальной оси – соответствующие им величины оптической плотности, выявленные по прибору. На месте пересечения этих величин ставят точки, затем проводят калибровочную кривую с таким расчетом, чтобы она охватила большинство точек (рис.3).

Показатели оптической плотности

        2,0  

        1,8 –

        1,6 –

        1,4 –

        1,2 –

        1,0 –

        0,8 –

        0,6 –

        0,4 –

        0,2 –

           0

                   0,2 0,6  1,0 1,4  1,8 2,2

                     Концентрация сперматозоидов в млрд/мл

Рис. 3. Калибровочная кривая для определения

концентрации спермы быков

 на фотоэлектроколориметре.

Калибровочную кривую следует выводить для каждого прибора в отдельности и время от времени ее проверять. При массовых исследованиях можно пользоваться коэффициентами-множителями (это возможно при прямолинейной зависимости между величиной концентрации и величиной отсчета прибора). Для этого необходимо среднеарифметическую концентрацию (15–20) эякулятов разделить на соответствующую ей среднеарифметическую величину оптической плотности тех же эякулятов.

Имея коэффициент-множитель и зная величину оптической плотности исследуемого эякулята, установленную на приборе, можно легко определить его концентрацию. Для этого необходимо перемножить эти величины.

Наиболее точно определить концентрацию сперматозоидов в сперме можно с помощью специальных электронных счетчиков (рис. 4). В этих приборах разбавленная сперма пропускается через капилляр так, что между электродами проходит только один сперматозоид. Головка его вызывает резкое увеличение сопротивления и это регистрируется счетчиком. Такие счетчики необходимы и при оценке качества

разбавленной спермы путем фильтрации через сэфадекс гель/стекло-вату.

Рис. 4. Современный прибор для определения концентрации сперматозоидов в сперме.

Приготовленный сэфадекс гель укладывается поверх пробки из стекловаты на дно пластикового шприца, используемого в качестве фильтрационной колонки. Фильтр колонки промывается буфером и в нее вносится небольшое количество спермы. Затем система промывается большим количеством буфера и в фильтрате подсчитывается число сперматозоидов. Мертвые или поврежденные клетки, а также отдельные формы абнормальных клеток остаются в фильтрационной колонке, тогда как живые проходят через нее. Считают, что целостность мембраны и поверхности сперматозоидов определяет возможность продвижения их через такую систему. Отмечена высокая степень зависимости оплодотворяющей способности спермы от соотношения живых и мертвых сперматозоидов.

В сохраняемой сперме можно определить количество сперматозоидов (в единице объема или дозе) по содержанию ДНК. Для определения ее необходим буфер, специальный краситель и флуорометр. В каждом сперматозоиде содержится 3,3 пкг ДНК.