Определение метаболической активности сперматозоидов
Поможем в ✍️ написании учебной работы
Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

 

Объекты исследования, материалы и оборудование: свежеполученная сперма, желток куриных яиц, 2,9%- и 3,6%-ный раствор натрия цитрата; дозаторы пипеточные и наконечники к ним, пипетки глазные,

палочки стеклянные; предметные стекла с луночками, стеклянные трубки с внутренним диаметром 0,8–1 мм, бактериологические пробирки; цилиндры мерные на 10, 100 и 1000 мл, колбы емкостью 100 мл и 1 л, банка из темного стекла с притертой пробкой; марлевые салфетки; водяная баня, метиленовая синька, физиологический раствор, минеральное (вазелиновое) масло; секундомер или часы, аналитические (точные) весы.

Предложены следующие методы определения метаболической активности сперматозоидов: измерение поглощения кислорода из расчета на стандартное число клеток, определение скорости обесцвечивания метиленовой сини, определение индекса фруктолиза и величины рН и др. Каждый из этих способов объективно отражает активность метаболических процессов, происходящих в сперматозоидах при температуре выше 20–25°С. Поэтому в большинстве случаев отмечают корреляционную связь данных, полученных с помощью этих методов, с основным показателем качества спермы – ее оплодотворяющей способностью. В практике обычно используют способ, основанный на способности сперматозоидов при отсутствии источника кислорода обесцвечивать метиленовую синьку.

Определение качества спермы по скорости обесцвечивания метиленовой синьки. В процессе гликолиза при окислении фосфоглицеринового альдегида выделяется водород, который переносится на пировиноградную кислоту, превращая ее в молочную. Метиленовая синь является хорошим акцептором водорода. При присоединении двух ионов водорода этот краситель теряет свой темно-синий цвет и превращается в лейкометиленовый синий, представляющий собой белый порошок. Водород фруктоза отдает под воздействием внутриклеточного фермента дегидрогеназы. Реакция должна происходить без доступа воздуха, так как кислород воздуха быстро окисляет лейкометиленовый синий в метиленовый.

 По методу Н.П. Шергина  на предметное стекло с луночкой дозатором пипеточным (глазной пипеткой) наносят каплю свежеполученной спермы быка или барана и добавляют каплю 0,01%-ного раствора метиленовой синьки. Быстро перемешивают обе капли стеклянной трубкой с внутренним диаметром 0,8–1 мм и набирают в нее смесь так, чтобы образовался столбик длиной около 2 см без пузырьков воздуха (пены). Трубку кладут на белую бумагу при температуре 20–22°С и наблюдают, через какое время голубой столбик обесцветится. По концам, где мениски смеси соприкасаются с воздухом, окраска обычно не изменяется. Оценивают сперму исходя из сроков обесцвечивания смеси:  хорошее качество – для быка 5–10 и для барана 3–7 мин, среднее – соответственно 11–30 и 8–12 мин, плохое – более 30 мин для быка и более 12 мин для барана.

Раствор метиленовой синьки необходимо приготовить заранее. Для этого сначала готовят 1000 мл физиологического раствора на дистиллированной воде, затем растворяют в нем 100 мг краски. Краску переливают в банку из темного стекла с притертой пробкой и хранят в закрытом шкафу.

В качестве стеклянных трубочек можно использовать кусочки разбитых шприцев-катетеров для осеменения коров. Концы таких трубочек шлифуют наждаком или напильником.

Метод Бека и Солсбери ( Beck G. H., Salisbury G. W.). В бактериологическую пробирку (объем 10 мл) вносят 0,2 мл свежеполученной спермы и 0,8 мл желточно-цитратной среды (40 мл 2,9%-ного раствора натрия цитрата и 10 мл желтка); тщательно смешивают. Добавляют 0,1 мл раствора метиленовой синьки, приготовленного из 50 мг красителя и 100 мл 3,6%-ного раствора натрия цитрата (Na3C6H5O7∙2H2O). Содержимое пробирки смешивают и покрывают слоем минерального (вазелинового) масла толщиной 1,25 см. 

Затем пробирку помещают в водяную баню с температурой 43–46°С. При такой температуре восстановление метиленовой синьки происходит наиболее быстро. Бактерии, попавшие в образец при получении или обработке спермы, не оказывают влияния на результаты, так как многие из них погибают. Лучшие по качеству эякуляты быка обесцвечивают краситель в течение 3–6 мин.

 

Дата: 2018-11-18, просмотров: 556.