Определение концентрации сперматозоидов в сперме
Поможем в ✍️ написании учебной работы
Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

Концентрацию сперматозоидов можно определить: 1) путем подсчета в счетной камере, 2) методом сравнения со стандартами, 3) с помощью фото-электроколориметра или специальных электронных счетчиков.

Определение концентрации сперматозоидов путем подсчета в счетной камере. Счетная камера Горяева представляет собой пластинку из толстого стекла, поделенную желобами на поля: центральное и два опорных. Центральное поле разделено средним поперечным желобом на две части. Это поле на 0,1 мм ниже опорных полей; на каждой половине его нанесена сетка. При помещении на опорные поля покровного стекла над сетками образуется камера 0,1 мм глубиной. Чтобы шлифованное покровное стекло прочно держалось, его помещают на чистую и обезжиренную спиртом камеру и, прижимая пальцами к опорным полям, притирают до появления радужных колец.

Исследуемую сперму необходимо разбавить дистиллированной водой или 3%-ным раствором натрия хлорида. Для этого используются смесители (меланжеры). Смесители должны быть чистыми и сухими. Поэтому после использования их промывают многократно дистиллированной водой, а затем 96%-ным спиртом и эфиром (1:1) и высушивают путем продувания воздуха резиновым баллоном или шарами Ричардсона. Для удобства в работе каждый смеситель присоединяют к   резиновой трубке (15–20 см), к другому концу которой  присоединен кусочек зашлифованной стеклянной трубки. Перед использованием кончик пипетки смесителя обеззараживают спиртовым тампоном. Обеззараженную часть пипетки слегка погружают в сперму, берут в рот кончик резиновой трубки (отрезок стеклянной трубки) и осторожно набирают сперму до нужной метки.

Для спермы быка и барана применяют эритроцитарный смеситель (с красным шариком), для спермы жеребца и хряка – лейкоцитарный (с белым шариком).

Сперму барана разбавляют в 200 раз, набирая сперму до метки 0,5, а воду – до 101.

Сперму быка разбавляют в 100 раз, набирая ее до метки 1,0, а воду – до 101.

Сперму жеребца и хряка разбавляют в 20 раз, набирая ее до метки 0,5, а воду – до метки 11.

Смеситель зажимают пальцами с обеих сторон и встряхивают в течение 2–3 минут до полного смешения спермы с дистиллированной водой. После перемешивания первые 3–4 капли из смесителя сливают отдельно и заряжают камеру, поднеся кончик смесителя к центральному полю у края покровного стекла. Смесь при этом заполняет пространство между центральным полем и покровным стеклом. Если часть капли останется у края покровного стеклышка, ее необходимо осторожно снять комочком сухой ваты. Другую сетку можно заполнить другим образцом спермы. Камеру помещают на предметный столик микроскопа (строго горизонтальное расположение!), устанавливают увеличение 200х, подбирают необходимое освещение и осторожно наводят микроскоп. Сперматозоидов подсчитывают в пяти больших квадратах сетки (по диагонали), каждый из которых поделен на 16 малых квадратов.

Концентрацию сперматозоидов вычисляют по формуле

С=  N х Д х 4000 х 1000 ,

n

 

где С – концентрация сперматозоидов;

  N – количество подсчитанных сперматозоидов;

  Д – степень разбавления спермы водой;

  п – количество малых квадратов, в которых производился

        подсчет (80);

4000 – количество малых квадратов в одном мм3;

1000 – мм3 в одном см3.

Удобнее пользоваться упрощенными формулами, которые получены из приведенной выше:

а) формула для расчета концентрации спермы барана

С = N/200;

б) формула для расчета концентрации спермы быка

С = N/100;

в) формула для расчета концентрации спермы жеребца и хряка

С = N/1000,

где С – концентрация сперматозоидов в сперме, млрд/мл;

  N – количество сперматозоидов, подсчитанных в пяти больших

        (80 малых) квадратах.

Определение концентрации сперматозоидов методом сравнения со стандартами. Стандарты представляют собой запаянные пробирки, в которых находится похожая на сперму жидкость (раствор сернокислого бария). Содержимое каждой пробирки имеет внешний вид и оптическую плотность, соответствующие сперме различной концентрации. В наборе стандартов для спермы быка имеются образцы, соответствующие концентрации 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 и 1,4 млрд/мл, для жеребца – 10, 50, 100, 200, 300 и 500 млн/мл.

Пустую пробирку такого же диаметра, как и стандарты, заполняют исследуемой спермой и сравнивают с ними. Пробирки просматривают на свет, подбирая стандарт, близкий по прозрачности к исследуемой сперме. Указанная на стандарте концентрация принимается за концентрацию данной спермы.

Дата: 2018-11-18, просмотров: 430.