Вирус SV40 (англ. Macaca mulatta polyomavirus 1, ранее Simian virus 40) — вид полиомавирусов, обнаруженный в клетках обезьян, из рода Betapolyomavirus, является типовым видом рода. Как и у других полиомавирусов, геном SV40 представлен кольцевой двуцепочечной ДНК.

Вирус SV40 имеет икосаэдрический вирион, содержащий геномную ДНК длиной около 5000 пар оснований. Вирион прикрепляется к рецепторам MHC класса 1 на поверхности клетки при помощи гликопротеина VP1. Внутри ядра клетки клеточная РНК-полимераза II экспрессирует ранние гены. Транскрибированная мРНК подвергается разрезанию на два фрагмента, кодирующие большой и малый Т-антигены. Около 5 % большого Т-антигена поступает в плазматическую мембрану клетки, а около 95 % поступает в ядро. В большой Т-антиген связывается с тремя сайтами в вирусной ДНК, связывание с сайтом I и II регулирует синтез ранних РНК, связывание со вторым сайтом происходит в каждом клеточном цикле II. Связывание с сайтом I вызывает репликацию ДНК в месте ориджина репликации. Сборка вирионов осуществляется в ядре клетки.

SV 40 – обезьяний вирус – содержит 2-нитевую ДНК размером 5 тыс. пар оснований. Он может с различным результатом размещаться в клетках макак резус и в клетках грызунов. При заражении обезьян данный вирус проходит литический цикл развития, т. е., после проникновения в цитоплазму клетки, происходит раздваивание вируса. ДНК попадает в ядро клетки, где начинается транскрипция ранних, а затем и поздних генов.

Ранние гены обеспечивают образование вирусных НК и обозначаются как T, t-антиген.

Поздние гены – обеспечивают образование 3 белков вирусного капсида VP 1, VP 2, VP 3.

В результате происходит образование зрелых вирусных частиц, ч/з 30 мин – лизис инфицированной клетки. Клетки, в которых происходит литический цикл развития – клетки пермиссивные.

Если SV 40 попадает в организм грызуна, он встраивается в одну из хромосом и развивается. Наблюдается неупластическая трансформация – непермиссивные. Необходимо наличие точки начала репликации, наличие регуляторной последовательности, для начала транскрипции и-РНК. Суммарные размеры рекомбинантной ДНК не должны быть более 5 тыс. пар оснований. Либо в составе рекомбинантной ДНК, либо в составе генома клетки д. б. гены, которые обеспечивают образование белков малого и большого антигена, а также белков вирусного капсида.

В настоящее время существует 3 вектора на основе SV 40.

1. Векторы трансдуцирующие – рекомбинантные ДНК вводятся в пермиссивные клетки, которые образуют вирусные частицы.

2. Векторы плазмидные - рекомбинантные ДНК вводятся в непермиссивные клетки, в которые она за определенное время либо встраивается, либо наследуется как плазмида.

3. Векторы пассивные (трансформирующие векторы) – служат для введения ДНК в клетки, обеспечивая ее встраивание в хромосому, но сам вектор в клетке не наследуется.

С учетом этих подходов можно использовать 2 приема для введения рекомбинационной ДНК в клетку. В составе вирусной ДНК на чужеродном фрагменте можно заменить либо ранние области генома, либо поздние. В случае, если идет замещение поздней области генома, необходимо использовать вирусы-помощники, прошедшие постртрасвекции или заражение 2 типовыми вирусными частицами, которые различаются дефектам в ранней или поздней области гена. Образуется потомство с частицами без рекомбинантных ДНК и с частицами вируса-помощника.

Замещение ранней области генома – используются специальные клеточные линии (cos линии клеток) в которой содержатся гены связанные с образованием малого и большого Т-антигена и при попадании в такие клетки рекомбинантных ДНК инициируется репликация такой ДНК, синтезируются белки вирусной оболочки и образуются вирусные частицы, все из которых содержат рекомбинационные ДНК.

Из-за насыщенности генетической структу­ры вируса SV40 лишь в ограниченном числе мест на его ДНК могут происходить незначи­тельные перестройки типа вставок или делеций без потери жизнеспособности вируса. При встройке в ДНК данного вируса чужеродного фрагмента по любому из уникальных мест гид­ролиза рестриктазами будет происходить нару­шение той или иной функции (см. рис. 14.1), т. е. гибридные вирусы SV40 будут дефектны. Чтобы гибридная ДНК могла упаковаться в ви­русный капсид, ее размер должен составлять 70-100 % генома вируса. Поэтому для получе­ния гибридного вирусного потомства необходи­мо чужеродный фрагмент ДНК встраивать в мо­лекулу вирусной ДНК, у которой предваритель­но с помощью рестриктаз делетирован опреде­ленный район. Такие векторы являются векто­рами замещения. Обязательное условие при конструировании гибридных вирусов — сохра­нение неповрежденной области начала репли­кации вирусной ДНК. Нарушенные при встрой­ке в векторную ДНК другие вирусные функции необходимо комплементировать с помощью ви- руса-помощника. Молекулярные векторы дан­ного типа на основе ДНК вируса SV40 называ­ют литическими векторами.

В большей части выполненных исследова­ний гибридные вирусы SV40 получены замеще­нием участка ДНК из области поздних генов ви­руса фрагментом чужеродной ДНК. Гибриды данного типа содержат полностью область ран­них генов и репликатор вируса SV40 и могут размножаться в виде вирусных частиц при со­вместной инфекции пермиссивных клеток с ви­русом-помощником дикого типа или термочув­ствительным мутантом по ранним генам (обыч­но tsA).

Для встройки фрагментов ДНК в область поздних генов вируса SV40 можно использо­вать рестриктазы Нра\\, ЕсоШ, ВатШ, НаеII, Accl, Kpnl, имеющие уникальные места гидро­лиза на вирусной ДНК, а также Hhal, имеющую два участка гидролиза (см. рис. 14.1). При ис­пользовании других рестриктаз обычно прово­дят неполный гидролиз вирусной ДНК, продук­ты гидролиза разделяют электрофорезом и век­торный фрагмент ДНК SV40 выделяют из геля.

49. Организация РНК-содержащих онкогенных вирусов (ретровирусов). Провирусная ДНК, экспрессия, длинные концевые повторы (LTR).

К РНК-содержащим вирусам относятся многие вирусы растений, возбудители заболеваний человека и животных: вирус полиомиелита, вирусы гриппа А, В и С, вирусы паротита (свинки), кори, чумы плотоядных животных (чумки), бешенства, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Многие РНК-содержащие вирусы вызывают ОРВИ (например, коронавирусы), желудочно-кишечные заболевания (реовирусы птиц, млекопитающих и человека).Вирионы РНК-содержащих вирусов содержат РНК. После проникновения в клетку вирусная РНК становится матрицей для синтеза ДНК и РНК.

Вирионы ретровирусов представляют собой округлые частицы, обладающиетрехслойной структурой. Центральная часть вириона представлена нуклеопротеиновым комплексом, который включает молекул ревертазы . Эта структура окружена капсидом-белковой оболочкой.Геном ретровирусов уникален в следующих отношениях: 1) является единственным диплоидным; 2) вирусная РНК синтезируется и изменяется с помощью механизма, изменяющего клеточную мРНК; 3) это единственный геном, связанный со специфическим переносом функции РНК целиком к первичной репликации; 4) это единственный геном, кодирующий обратную транскриптазу, которая сама по себе уникальна.

В сердцевине содержатся две идентичные молекулы одноцепочечной РНК (то есть геном ретровирусов диплоидный) длиной 8000-10000 нуклеотидов каждая, тРНК , а также некоторые белки, например обратная транскриптаза и интеграза . Концы вирусной РНК модифицированы как у мРНК : на 5'-конце находится 7-метилгуанозин, необходимый для инициации трансляции , на З'-конце - полиадениловая последовательность, которая определяет стабильность мРНК (чем короче полиадениловая последовательность, тем быстрее происходит распад матрицы).

Ретровирусная РНК участвует не в синтезе белка, а транскрибируется с образованием ДНК. ДНК-форму ретровирусного генома называют провирусом. После проникновения в клетку вирусу, чтобы жить и развиваться, необходимо свою генетическуюинформацию, записанную в форме полимерной молекулы РНК, превратить в ДНКовую форму . Для этого клетка синтезирует белок-фермент, закодированный в вирусном геноме, под названием обратная транскриптаза . Этот фермент осуществляет образование на РНК однонитевой ДНК-копии. Затем с помощью того же фермента достраивается вторая нить ДНК. Новосинтезированная двунитевая ДНК-копия вируса получило название провируса. ДНК провируса имеет размер около 10 тыс. пар нуклеотидов и окружена с обеих сторон одинаковыми последовательностями нуклеотидов, называемыми длинными концевыми повторами- LTR, размером по 600-700 п.н. каждый . В этих длинных концевых повторах содержатся все необходимые для регуляции работы генов элементы, которые управляют работой вирусных генов в новом для них месте.

LTR, long terminal repeats. Последовательности LTR включают в себя последовательности STR. Возникновение LTR очень важно для экспрессии вирусных генов. Они содержат вирусные регуляторные транскрипционные элементы: промотор, энхансер, и другие. Например, некоторые вирусы содержат элементы, определяющие зависимость вирусной транскрипции от наличия определённых гормонов. LTR и являются теми регуляторными сигналами, которые вирус использует для эксплуатации клеточной транскрипционной машины в своих целях.

Продуктом транскрипции является полноразмерная вирусная РНК. Она должна транслироваться. И здесь вирусу необходимо решить такую проблему: нужно синтезировать много белков, а РНК одна. И в клетках эукариот РНК моноцистронны, то есть предназначены для синтеза только одного белка. Синтез белка в большинстве случаев начинается с ближайшего к кэп-сайту инициирующего кодона[4].

Если просмотреть открытую рамку считывания от этого ближайшего инициирующего кодона, то мы увидим, что если бы вирус пользовался традиционными способами экспрессии, то он смог бы синтезировать только полипептид GAG. А дальше идёт стоп- кодон. Как быть с POL и ENV? Кроме того, эти полипептиды очень длинны, а в вирусе содержатся гораздо более короткие. Проблема решается несколькими способами.

ü Во-первых, с помощью сплайсинга эта одна РНК превращается в нашем упрощённом варианте ещё в одну, более короткую. При этом последовательности, кодирующие ENV полипептид, оказываются рядом с инициирующим кодоном, ближайшим к кэп-сайту, и начинают транслироваться.

ü Во-вторых, разными для разных ретровирусов способами они ухитряются обойти стоп-кодон после открытой рамки считывания GAG и синтезировать сплавленный полипетид GAG-POL, который содержит последовательности обеих групп белков.

ü В-третьих, полученные длинные полипептиды подвергаются процессингу и разрезаются на множество белков, которые и функционируют либо в роли регуляторных, как, например, обратная транскриптаза, либо в роли структурных, как, например, белки оболочки зрелых вирусов.

Иными словами, ретровирусы используют гибкую тоталитарную систему для весьма тонкой регуляции синтеза большого разнообразия белков под контролем одного промотора.

Ретровирусы могут применяться в качестве векторов, например, в генотерапии. Механизм проникновения внутрь клеток при помощи слияния мембран. У них есть ряд преимуществ: широкий круг хозяев, стабильность в интегрированном в геном хозяина состоянии. Недостатки: сложно добиться высокого титра, заражает только делящиеся клетки.