В связывании РНК-полимеразы участвует α-субъединица, распознающая элемент ДНК, предшествующий гену (-40…-70 шагов), и σ-фактор, распознающий участок −10…-35. Существует большое количество σ-факторов, контролирующих экспрессию генов. Например: σ70, который синтезируется в нормальных условиях и позволяет РНК-полимеразе связываться с генами, отвечающими за метаболические процессы клетки; или σ32, блокирующий связывание РНК-полимеразы с генами белков теплового шока.

После связывания с ДНК структура РНК-полимеразы превращается из закрытой в открытую. Это превращение включает в себя разделение моноспиралей ДНК с образованием раскрученного участка длиной около 13 шагов. Рибонуклеотиды затем собираются в цепочку в соответствии с базовой нитью ДНК, используемой в качестве шаблона. Суперскрученность молекул ДНК играет существенную роль в деятельности РНК-полимеразы: поскольку участок ДНК перед РНК-полимеразой раскручен, в нем существуют положительные компенсационные супервитки. Участки ДНК позади РНК-полимеразы снова закручиваются и в них присутствуют отрицательные супервитки.

Элонгация

Во время элонгационной фазы транскрипции происходит добавление рибонуклеотидов к цепи и переход от структуры РНК-полимеразного комплекса от открытой к транскрипционной. По мере сборки молекулы РНК участок ДНК перед РНК-полимеразой раскручивается далее, и 13-парный открытый комплекс превращается в 17-парный транскрипционный комплекс. В этот момент промотор (участок ДНК −10…-35 шагов) завершается, и σ-фактор отделяется от РНК-полимеразы. Это позволяет остальному РНК-полимеразному комплексу начать движение вперед, так как σ-фактор удерживал его на месте.

17-парный транскрипционный комплекс содержит гибрид ДНК и РНК, содержащий 8 пар оснований — 8-шаговый участок РНК, соединенный с шаблонной цепью ДНК. По мере выполнения транскрипции рибонуклеотиды добавляются к 3'-концу собираемой РНК, и РНК-полимеразный комплекс движется по цепи ДНК. Хотя в РНК-полимеразе не обнаружено свойств, характерных для 3'-экзонуклеазы, аналогичных проверочной деятельности ДНК-полимеразы, есть свидетельства того, что РНК-полимераза останавливается и корректирует ошибки в случаях ошибочного формирования пар оснований ДНК-РНК.

Добавление рибонуклеотидов к РНК обладает механизмом, очень близким к полимеризации ДНК. Считается, что ДНК- и РНК-полимеразы могут быть эволюционно связаны. Аспарагиновые остатки в РНК-полимеразе связываются с ионами Mg2+, которые, в свою очередь, осуществляют выравнивание фосфатных групп рибонуклеотидов: первый Mg2+ удерживает α-фосфат нуклеотидтрифосфата, подлежащего добавлению в цепочку. Это позволяет осуществить связывание нуклеотида с 3' OH-группой конца собираемой цепочки и таким образом добавить НТФ в цепочку. Второй Mg2+ удерживает пирофосфат НТФ. Общее уравнение реакции таким образом имеет вид:

(НМФ)n + НТФ --> (НМФ)n+1 + ПФi

Терминация

Терминация транскрипции РНК может быть ρ-независимой либо ρ-зависимой.

ρ-независимая терминация осуществляется без помощи ρ-фактора. Транскрипция палиндромного участка ДНК приводит к формированию шпильки из РНК, зацикленной и связанной с самой собой. Эта шпилька богата гуанином и цитозином, что делает её более стабильной, нежели гибрид ДНК-РНК. В результате 8-парный гибрид ДНК-РНК в транскрипционном комплексе сокращается до 4-парного. В случае если эти 4 последние пары оснований составлены слабыми аденином и уридином, молекула РНК отделяется.

Эукариоты обладают различными типами РНК-полимераз, классифицируемыми по типам РНК, которые они производят:

РНК-полимераза I, синтезирующая 45S-предшественника рРНК, превращающуюся затем в рРНК 28S, 18S и 5,8S, которые уже образуют главные РНК-секции рибосомы.[8]

РНК-полимераза II, производящая предшественников для мРНК, а также для большинства мяРНК и миРНК.[9] Это наиболее хорошо изученный тип РНК-полимеразы. Ввиду того, что транскрипция должна происходить под строгим контролем, РНК-полимеразе II для связывания с промоторами требуется целый набор факторов транскрипции.

РНК-полимераза III, синтезирующая тРНК, 5S рРНК и другие малые РНК, присутствующее в ядре и цитозоле

Опишите механизмы трансляции мРНК у прокариот. Основные этапы синтеза белков. Каким образом происходит выбор стартового AUG- кодона (SD-aSD) у прокариот? Рибозимная активности 23S рРНК.

Как и у эукариот, у прокариот выделяют три основных этапа трансляции: инициация, элонгация и терминация.

Инициация.

Инициация трансляции у прокариот обслуживается белковыми факторами инициации IF (от англ. initiation factors). У бактерий существуют три фактора: IF-1, IF-2, IF-3. IF-2 обладает ГТФазной активностью и играет важнейшую роль в связывании инициаторной аминоацил-тРНК (тРНК с присоединённой аминокислотой). Факторы IF-1 и IF-2 влияют на конформацию малой субъединицы, помогая ей связываться с тРНКfMet, переносящей формилметионин. Как правило, она связывается со старт-кодоном AUG, но иногда в роли старт-кодона выступает кодон CUG, кодирующий валин. Комплементарно спариваясь со старт-кодоном, тРНКfMet задаёт рамку считывания. Выбор старт-кодона осуществляется при связывании малой субъединицы с мРНК, причём инициаторная тРНКfMet связывается с малой субъединицей в комплексе с факторами инициации и ГТФ. Выбор стартового кодона у бактерий происходит с участием последовательности Шайна — Дальгарно — короткой последовательности длиной 5—8 нуклеотидов, обогащённой пуриновыми основаниями и комплементарно связывающейся с обогащённой пиримидинами областью 16S рРНК, входящей в состав малой субъединицы. Когда комплекс малой субъединицы с мРНК и тРНКfMet образовался, факторы IF-3 и IF-1 покидают его, уступая место большой субъединице, присоединение которой завершает сборку рибосомы прокариот. При присоединении большой субъединицы формируются Р- и А-сайты. Далее фактор IF-2 гидролизует ГТФ, и выделившаяся энергия расходуется на стабилизацию тРНКfMet в Р-сайте рибосомы.

У бактерий в элонгации ключевую роль играют особые белковые факторы — EF-Tu и EF-G. Сначала EF-Tu одновременно связывает ГТФ и молекулы аминоацил-тРНК. Этот фактор обеспечивает точность трансляции несколькими способами. Во-первых, когда EF-Tu препровождает до рибосомы аминоацил-тРНК, он проверяет соответствие тРНК и несомой аминокислоты. Во-вторых, он отслеживает первичное взаимодействие между антикодоном подходящей аминоацил-тРНК и кодоном мРНК в А-сайте. Когда аминоацил-тРНК находится в комплексе с EF-Tu, связанным с ГТФ, то она изогнута так, что её антикодон может связаться с кодоном мРНК, но аминокислота не может быть включена в белковую цепь. Однако в случае правильного соответствия кодона и антикодона рибосома запускает быстрый гидролиз ГТФ, после которого EF-Tu отсоединяется от тРНК и рибосомы, так что аминокислота может быть включена в цепь. Проверка соответствия кодона и антикодона осуществляется самой рибосомой: рРНК обёртывается вокруг пары кодон—антикодон, и при её окончательном замыкании, которое имеет место только в случае правильного соответствия, происходит гидролиз ГТФ. Отделившийся EF-Tu, связанный с ГДФ, обменивает свой ГДФ на ГТФ при участии ещё одного фактора элонгации, EF-Ts, который катализирует отделение ГДФ от EF-Tu.

Вновь поступившая аминокислота, связанная с тРНК, оказывается в А-сайте рибосомы. В это время в Р-сайте рибосомы находится тРНК, к которой прикреплён синтезированный участок пептида (или инициаторная аминокислота). В Р-сайте рибосомы происходит пептидилтрансферазная реакция, при которой аминокислота из А-сайта присоединяется к пептиду. Таким образом, после этой реакции в Р-сайте оказывается пустая молекула тРНК, а в А-сайте находится тРНК, связанная с пептидом. После этого большая субъединица рибосомы смещается относительно малой на три нуклеотида, и пустая тРНК оказывается в Е-сайте, откуда она покидает рибосому и отправляется за следующей молекулой аминокислоты, а синтезированный пептид, связанный с тРНК, оказывается в Р-сайте; А-сайт же освобождается для новой аминоацил-тРНК. Смещение большой субъединицы (транслокация) требует гидролиза ГТФ, который осуществляет белок EF-G, связывающийся с опустевшим А-сайтом[4].

Первый на N-конце белка аминокислотный остаток формилметионина впоследствии отщепляется при участии аминопептидаз.

Терминация.

У бактерий в терминации трансляции принимают участие три белковых фактора: RF-1, RF-2 и RF-3, которые распознают стоп-кодоны в мРНК: RF-1 узнаёт кодоны UAG и UAA, а RF-2 распознаёт UAA и UGA. Фактор RF-3 выполняет вспомогательную работу. Трёхмерная структура RF-1 и RF-2 напоминает формой и распределением заряда тРНК и, таким образом, представляют собой пример молекулярной мимикрии. Когда в А-сайт рибосомы попадает стоп-кодон, с ней связывается соответствующий RF-фактор и тем самым блокирует присоединение аминоацил-тРНК. Кроме того, в клетках обычно нет тРНК, комплементарных стоп-кодонам. RF стимулируют пептидилэстеразную активность рибосомы, что приводит к гидролизу связи между С-концом новосинтезированного пептида и тРНК. В результате белок удаляется из рибосомы, и она сама диссоциирует на большую и малую субъединицу. Терминация трансляции происходит с участием ГТФ, который выступает в роли аллостерического регулятора активности RF.

мРНК бактерий обычно полицистронны, то есть содержат несколько старт- и стоп-кодонов. Хотя рибосома бактерий и распознаёт терминирующие кодоны, она может продолжить движение по мРНК и начать трансляцию следующей кодирующей области.