1. Двунитчатая ДНК - обычная полуконсервативная репликация.

2. Однонитчатая ДНК –  репликация происходит через стадии репликативной формы и промежуточной репликативной формы.

3. Однонитчатая РНК – репликация происходит через две стадии. Вначале на вирионной РНК (вРНК) синтезируются комплементарные РНК (кРНК). Затем на кРНК синтезируются вирионные РНК.

4. Репликация однонитчатой РНК ретровирусов происходит с участием обратной транскриптазы. Вначале на вРНК обратная транскриптаза синтезирует минус-цепь ДНК, а затем на ней синтезирует плюс-цепь ДНК. Двунитевая ДНК служит матрицей для синтеза вРНК.

5. Размножение вируса гепатита В также протекает с участием обратной транскриптазы. Вначале клеточная РНК-полимераза синтезирует на вирусной ДНК прегеномную РНК, а затем вирусная обратная транскриптаза синтезирует на ней минус-цепь ДНК, на которой затем достраивает плюс-цепь ДНК.

Е. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний

1. Вирусоскопический – обнаружение в исследуемом материале с помощью методов электронной микроскопии вирионов или с помощью светооптической микроскопии вирионов или внутриклеточных включений.

2. Обнаружение вирусов в исследуемом материале с помощью методов иммуноэлектронной микроскопии.

3. Вирусологические методы –  выделение чистых культур вирусов и их идентификация с использованием культур клеток или куриных эмбрионов.

4. Серологические методы – обнаружение противовирусных антител в сыворотке больного или реконвалесцента с помощью реакций нейтрализации вирусов, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации, иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного метода (РИМ), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), реакции гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс АГ+АТ в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах), реакции преципитации в агаре, иммунофлуоресцентного метода. Эти же реакции могут быть использованы и для обнаружения вирусных ан­тигенов в исследуемом материале.

5. Биологические методы – заражение чувствительных к данному вирусу лаборатор-ных животных с целью воспроизведения заболевания или последующего выделения вируса.

6. Молекулярно-генетический – с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или гибридизации нуклеиновых кислот (ДНК- и РНК-зонды) определяют в исследуемом материале наличие возбудителя вирусного заболевания по специфичным для него последовательностям нуклеотидов.

З А Н Я Т И Е 12

Дата ______________

Тема: Морфология и ультраструктура вирусов. Клеточные культуры. Репродукция вирусов. Методы индикации вирусов

План занятия:

1. Культивирование вирусов в культурах тканей (окончание):

а) изучение цитопатического эффекта - макро- и микроскопии культур клеток, зараженных вирусом осповакцины;

б) выявление размножения вирусов в культуре ткани реакцией гемадсорбции (демонстрация готовых препаратов);

в) обнаружение вируса в культуре ткани методом цветной пробы (демонстрация);

г) выявление вируса в культуре ткани методом бляшек (демонстрация);

д) обнаружение вируса в культуре ткани с помощью флуоресцирующих антител. Разбор методики.

2. Культивирование вирусов в курином эмбрионе (окончание):

а) вскрытие зараженных куриных эмбрионов и изучение изменений в них;

б) постановка реакции гемагглютинации;

в) определение типа вируса гриппа в аллантоисной жидкости с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Методические указания

1. Культивирование вирусов в культурах тканей

а) Цитопатический эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.

Промикроскопировать культуру ткани, зараженную вирусом осповакцины. Зарисовать.

б) Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Методика реакции. В пробирки о зараженной вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4% взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубация и вида вируса. Учёт реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.

Зарисовать картину гемадсорбции.

Рис.1. Культура клеток, зараженная вирусом _______________ (цитопатический эффект) окраска по Романовскому	Рис.2. Реакция гемадсорбции окраска по Романовскому

в) Цветная реакция. В основу реакции положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, снижающие рН среды. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, в силу чего подавляется их метаболизм и не происходит изменение рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый красный. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7 – оранжевый и при рН ниже 7 – желтый.

Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), рH питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. В случае размножения вируса клетки дегенерируют, и среда сохраняет исходный красный цвет.

Метод цветных проб может быть использован для титрования вируса или вируснейтрализирующих антител.

Цветные пробы зарисовать.

г) Метод бляшек предложен Р. Дюльбекко для получения изолированных колоний вируса. В основе метода лежит появление в монослое зараженных вирусом клеток обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующегося из одной вирусной частицы.

Метод заключается в следующем. В специальном флаконе на стенке выращивают монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону, и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек разной формы и величины, что зависит от вида вируса.

Феномен бляшкообразования зарисовать.

д) Метод флуоресцирующих антител основан на появлении специфического свечения в местах локализации вируса при обработке зараженной ткани флуоресцирующими антителами. Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках. Препарат промывают физиологическим раствором, подсушивают и фиксируют в ацетоне при 4^°С в течение 10 мин. Затем препарат окрашивают специфической флуоресцирующей сывороткой в течение 30 мин при 37^°С. После окраски препарат промывают физиологическим раствором и высушивают. Просмотр препарата производят с помощью люминесцентного микроскопа.

2. Культивирование вирусов в курином эмбрионе

а) Вскрытие куриных эмбрионов. Работу проводят в стерильных условиях. Яйцо ставят воздушным мешком кверху, место вскрытия смазывают спиртом, йодом, еще раз спиртом, обжигают, снимают колпачок и ножницами удаляют прилегающую к отверстию часть скорлупы. Пинцетом снимают подскорлупную оболочку, прокалывают пастеровской пипеткой хорионаллантоисную оболочку и из полости отсасывают аллантоисную жидкость, содержащую вирус. Жидкость помещают в стерильную пробирку.

Для исследования хорионаллантоисной оболочки из яйца удаляют всё содержимое. Оболочка остается на внутренней поверхности скорлупы или выпадает вместе с содержимым яйца. Оболочку осторожно вынимают пинцетом, помещают в чашку Петри, промывают физиологическим раствором, тщательно расправляют и рассматривают на темном фоне изменения, имеющиеся в ней. Изменения на оболочке строго специфичны. Например, вирус осповакцины вызывает образование многочисленных беловатых втянутых в центре бляшек.

б) Реакция гемагглютинации. Аллантоисную жидкость проверяют на содержание вируса путем агглютинации куриных эритроцитов на стекле (и в пробирках - титрование вируса). Для постановки реакции на стекле к капле вируссодержащего материала добавляют одну каплю 5% взвеси эритроцитов. Реакция проходит в течение 5 мин.

Реакция гемагглютинации

Рис.5. 1 – опыт (к капле аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа, добавляют каплю 5% взвеси куриных эритроцитов) 2 – контроль (эритроциты + физ. р-р).

в) Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) может быть использована для определения типа вируса или типа и титра антител. Для определения типа вируса на предметное стекло наносят по одной капле вирусосодержащего материала (количество капель должно соответствовать количеству сывороток). В приготовленные капли последовательно вносят по одной капле типовых сывороток. Контролем служит физиологический раствор и нормальная сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по одной капле 5% взвеси эритроцитов. Результат регистрируют через 5 мин. При соответствии вируса типу сыворотки антитела связывают гемагглютинин вируса, и гемагглютинация не наступает (РТГА положительная). Эта реакция может быть поставлена и в пробирках с целью титрования вируса или анти­тел (антигемагглютининов).

Схема определения типа вируса реакцией торможения гемагглютиниции.

	Рис.6. В каплю вируссодержащей жидкости добавляют каплю типовой сыворотки и каплю 5% взвеси эритроцитов. К– контроль (эритроциты + физ. раствор).
Заключение:__________________________________________________________ _____________________________________________________________________

Контрольные вопросы

1. Как обнаруживают наличие вируса в культуре ткани?

2. Почему при размножении вируса цвет среды не изменяется?

3. С какой целью может быть использован метод цветных проб?

4. Какие изменения наступают в клетках при размножении вируса?

5. Как ставят реакцию гемадсорбции? Как выглядит положительная реакция гемадсорбции?

6. Что собой представляет метод бляшек?

7. Как обнаруживают вирус гриппа в курином эмбрионе?

8. Как вскрывают зараженный эмбрион?

9. Почему происходит реакция агглютинации эритроцитов в присутст­вии вируса гриппа? Каков механизм этой реакции?

10. Что такое реакция торможения (нейтрализация) гемагглютинации? Для чего она используется?

11. Как обнаруживают изменения в хорионаллантоисной оболочке, вы­званные вирусом?

ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ 12

Классификация цитопатического действия (ЦПД) вирусов в культуре ткани.

1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (вирусы Коксаки, ЕСНО, полиовирусы).

2. Очаговая мелкозернистая дегенерация (вирусы гриппа, клещевого энцефалита и др.).

3. Гроздевидная дегенерация (аденовирусы).

4. Крупнозернистая равномерная деструкция (вирус герпеса).

5. Симпластообразование (обезьяньи вирусы, вирусы кори, осповакцины, RS-вирус).