Т- хелперы и Т-супрессоры распознают чужеродные антигены в ассоциации с антигенами класса П, которые находятся на поверхности клеток, вовлеченных в иммунный ответ (Т- и В-лимфоциты, макрофаги и др.).
Таким образом, белки МНС класса II играют важную роль в повышении эффективности иммунного ответа.
Классификация и свойства интерферонов
В организме существует три антигенно различных типа молекул интерферона: α-,β-и γ-интерфероны, которые различаются по физико-химическим свойствам, биологии действия и оказывают разнообразное влияние на многочисленные функции клеток и тканей. Существует два вида рецепторов для различных интерферонов: один для α- и β-интерферонов (рецепторы I-го типа), другой - для γ -интерферона (рецепторы II-го типа).
Интерферон - альфа (IFN-α) - лейкоцитарный, стабилен при рН 2,0; взаимодействует с рецепторами 1-го типа.
Интерферон-бета (IFN- β) - фибробластный, стабилен при рН 2,0; взаимодействует с рецепторами 1-го типа.
Интерферон-гамма (IFN-γ ) - иммунный (лимфоцитарный), нестабилен при рН 2,0; взаимодействует с рецепторами II-го типа.
Основные свойства интерферонов:
противовирусное, иммуномодулирующее, противоопухолевое, противобактериальное (бактерицидное и бактериостатическое).
.З А Н Я Т И Е 10
Дата ______________
Тема: Итоговое контрольное занятие «Инфекция и иммунитет». Бактериофагия. Генетика микроорганизмов. Мутации и рекомбинации.
План занятия:
1. Вопросы к итоговому занятию «Инфекция и иммунитет».
2. Явление бактериофагии. Демонстрация феномена бактериофагии на жидких и плотных средах.
3. Методы титрования фага.
4. Типы и механизмы генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукция, конъюгация (разбор схем).
а) опыт трансдукции (разбор);
б) постановка опыта конъюгации.
5.Плазмиды бактерий. Классы и свойства R-плазмиды.
6.Молекулярные механизмы мутаций у бактерий (разбор).
7.Получение рекомбинантных молекул ДНК (разбор).
Методические указания
1. Вопросы к итоговому занятию «Инфекция и иммунитет».
1. Патогенность микроорганизмов. Определение понятия. Вирулентность, единицы ее измерения.
2. Иммунитет, определение понятия, классификация иммунитета.
3. Реакция связывания комплемента (РСК), техника постановки, учет результатов.
4. Основные группы факторов патогенности бактерий.
5. Главная система гистосовместимости человека (МНС), ее основные локусы и функции.
6. Реакция иммунофлуоресценции прямая и непрямая, цели использования, учет результатов.
7. Экзотоксины бактерий, их отличительные свойства.
8. Что такое гаптены, полугаптены, шлеппер, детерминантная группа (эпитоп)?
9. Что собой представляет реакция агглютинации и каково ее практическое использование?
10. Эндотоксины бактерий, их отличительные свойства.
11. Какие центральные и периферические органы иммунной системы Вы знаете?
12. Сущность реакции преципитации, методические варианты ее постановки.
13. Анатоксины, получение, практическое использование.
14. Что такое антигены, их основные свойства? Что такое «полноценный антиген» и «неполноценный антиген»?
15. В чем состоит сущность радиоиммунного метода диагностики (РИМ или РИА) инфекционных заболеваний?
16. Факторы адгезии и колонизации бактерий, их природа и значение.
17. Что такое «антитела»? Молекулярная структура иммуноглобулина класса G (IgG), цепи, фрагменты.
18. В чем состоит сущность иммуноферментного метода диагностики (ИФМ, ИФА, РЭМА) инфекционных заболеваний?
19. Анатомо-физиологические механизмы естественной резистентности.
20. Каким образом Т-хелперы управляют дифференцировкой и скоростью размножения В-лимфоцитов?
21. Развернутая реакция агглютинации, техника постановки. Понятие о титре агглютинирующий сыворотки.
22. Состав нормальной микрофлоры толстого кишечника человека. Почему она является мощным фактором естественной резистентности?
23. Чем отличается первичный иммунный ответ от вторичного?
24. Что собой представляет реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) и для каких целей она применяется?
25. Какие ферменты «защиты и агрессии» бактерий Вы знаете? Методы их обнаружения у бактерий?
26. Понятие о системе мононуклеарных фагоцитов. Функции макрофагов.
27. Какие варианты реакции агглютинации применяются в качестве экспресс-методов для диагностики инфекционных заболеваний?
28. Что такое «факторы инвазии»? Чем они могут быть представлены?
29. Формы иммунного ответа. Что такое «иммунологическая толерантность» и чем она обусловлена?
30. Классификация диагностических серологических реакций по технике постановки и механизму протекания.
31. Какие факторы патогенности являются «препятствующими фагоцитозу» и какие «подавляющими фагоцитоз»?
32. Формы иммунного ответа. Иммунологическая память, ее природа.
33. Понятие об иммунных сыворотках, их классификация, получение, титрование, практическое использование.
34. Методы определения токсигенности бактерий.
35. Формы иммунного ответа. Гиперчувствительность немедленного типа, механизм ее развития, клинические проявления.
36. Вакцины. Определение понятия, классификация, получение, использование.
37. Комплемент. Состав и основные функции.
38. Как осуществляется процессинг антигена и его презентация иммунокомпетентным клеткам?
39. Реакция Кумбса, сущность, преимущества перед другими серологическими реакциями.
40. Пути активации системы комплемента.
41. Антигены микробной клетки. Для чего необходимо знать антигенное строение микробной клетки?
42. Что такое «моноклональные» антитела? Какими свойствами они обладают и как их получают?
43. Что такое фагоцитоз? Его механизм и стадии. Понятие о завершенном и незавершенном фагоцитозе.
44. Что такое трансплантационный иммунитет и какими клетками иммунной системы он опосредуется?
45. Иммуносорбентные реакции, механизм их протекания.
46. Субпопуляции Т- и В-лимфоцитов, их основные функции.
47. Формы иммунного ответа. Отличительные особенности и природа гиперчувствительности замедленного типа.
48. Динамика развития инфекционного процесса. Причины хронизации инфекционного заболевания и формирования носительства.
49. Что такое инфекция? Ее основные формы.
50. Формы иммунного ответа. Идиотип-антиидиотипические взаимодействия, сущность и значение.
51. Значение серологического и аллергического методов в диагностике инфекционных заболеваний.
52. Источники инфекции. Классификации инфекций по источнику и этиологии. Пути и способы заражения человека.
53. Классы иммуноглобулинов. Их основные отличия, участие в различных иммунных реакциях in vivo и in vitro.
54. Что такое лимфокины? Какие функции они выполняют?
2. Явление бактериофагии. Демонстрация феномена бактериофагии на жидких и плотных средах
Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.
3. Методы титрования фага.
Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Грациа. Сущность этого метода состоит в следующем.1,5%-ный МПА с генцианвиолетом (0,1 мл 0,1% генционвиолета на 1 л среды), который добавляется для предохранения от загрязнения грамположительной воздушной микрофлорой, накануне опыта разливают по 25-30 мл в чашки Петри. Чашки хорошо просушивают в термостате или под бактерицидной лампой, после чего оставляют на ночь при комнатной температуре.
Перед опытом 0,7% МПА расплавляют и разливают по 2,5 мл в пробирки, охлаждают до 46-47°С и затем добавляют в пробирки по 1 мл исследуемого фага (предварительно разведенного) и 0,1 мл эталонной культуры, все это быстро и тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями, после чего выливают в чашки на поверхность 1,5% агара. Смесь осторожными движениями распределяют так, чтобы над слоем 1,5% агара образовался слои 0,7% агара, содержащего бактериофаг и чувствительную к нему культуру бактерий. Для застывания добавленного агара чашки оставляют на столе на 1-1,5 часа, а затем помещают в термостат при 37°С . Для получения четких результатов необходимо соблюдение следующих условий: а) чашки с 1,5% агаром должны быть хорошо высушены; б) чашки должны находиться после добавления 0,7% агара строго в горизонтальном положении во избежание стекания агара в одну сторону; в) расплавленный 0,7% агар после охлаждения до 46°С нельзя долго хранить, так как он может приобрести гелеобразную консистенцию.
Учет результатов титрования можно производить после 5-6-часового инкубирования в термостате. Для этого подсчитывают количество колоний фага («стерильных» пятен) и умножают полученное число на фактор разведения. Например, при посеве 1 мл фага, разведенного в 10-7 на чашке обнаружено 45 колоний, следовательно, титр фага равен 45×107 = 4,5×108 Зарисовать демонстрационный опыт титрования фага по Грациа.
| 
|
| Рис.1. Бактериофагия на плотной ПС («стерильные» пятна) | Рис.2. Титрование фага по методу агаровых слоёв (по Грациа) |
4. Типы и механизмы генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукция, конъюгация (разбор схем).
а) Опыт трансдукции.
К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиента Е. соli 1ас- добавляют в таком же количестве трансдуцирующий фаг, выделенный из культуры Е. соli 1ас+, в концентрации 106-107 . Смесь инкубируют при 37°С в течение часа, после чего 0,1 мл высевают на среду Эндо. В качестве контроля на среду Эндо высевают также культуру Е.соli lас+ (реципиент без фага). Посевы ставят на сутки в термостат. Учет результатов производят по числу выросших окрашенных колоний.
б) Опыт конъюгации.
Сущность опыта заключается в том, что от донорных клеток путем конъюгации передаются гены, контролирующие способность синтезировать треонин и лейцин, клеткам-реципиентам, ауксотрофным по этим аминокислотам.
В качестве донора используется культура Е. coli Hfr с генотипом tre+, lei+, met-, strs (strs – чувствительность к стрептомицину). Реципиентом служит культура Е. coli F– с генотипом tre-, lei-, met+, strr (strr - устойчивость к стрептомицину).
Для выделения рекомбинантов используют солевую среду М-9 со стрептомицином, содержащую глюкозы 1,0 г; стрептомицина – 200 ед/мл; NH4Cl – 1,0 г; NaС1 – 0,5 г; Na2HРO4 – 6,0 г; КH2PO4 – 3,0 г; Mg2SO4 – 0,2 г; дистиллированной воды – 1,0 л. Для тех же целей может быть использована плотная среда. В этом случае к указанному составу добавляется 20,0 г агар-агара.
На этой среде могут расти только рекомбинанты (трансконъюганты). Культуры донорного и реципиентного штаммов не растут на данной среде, так как первая ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а вторая ауксотрофна по треонину и лейцину.
Постановка опыта: к 2 мл 3-часовой бульонной культуры реципиента добавляют 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора. Смесь инкубируют в течение 30 минут при 37°С. Затем смесь разводят в 100 и 1000 раз и засевают разведения в объеме 0,1 мл на селективную среду для выделения рекомбинантов. В качестве контроля на такую же среду засевают культуры донора и реципиента в том же объеме. На следующие сутки регистрируют результаты опыта. В пробирках с посевом рекомбинанта наблюдается помутнение среды. В средах с посевами донорной и реципиентной культур роста нет. Аналогичным образом регистрируют результаты посевов на плотных средах.
Просмотреть посевы культур донора, реципиента и рекомбинантов на минимальной среде со стрептомицином. Обратить внимание на рост культуры рекомбинантов. Культуры донора и реципиента не растут на данной среде, так как культура донора ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а культура реципиента ауксотрофна по треонину и лейцину.
Контрольные вопросы
1. Что такое бактериофаг?
2. Каковы морфология, размеры и химический состав фагов?
3. Что содержится в головке бактериофага?
4. Как устроен хвостик фага и каково его назначение?
5. Из каких этапов складывается взаимодействие фага с микробной клеткой?
6. Каким образом фаг вводит свою нуклеиновую кислоту в микробную клетку?
7. Как осуществляется синтез фаговых частиц внутри микробной клетки?
8. Какая разница между вирулентным и умеренным фагом?
9. Что такое лизогения и лизогенная конверсия?
10. Как выделяют фаги из объектов внешней среды?
11. Какова методика определения титра фага по Грациа?
12. Что такое фаготипирование? С какой целью оно применяется?
13. Что такое ген?
14. Что таков мутации спонтанные и индуцированные?
15. Каков молекулярный механизм мутации?
16. Какие вы знаете мутагены?
17. Что такое ауксотрофы? Как получают ауксотрофные штаммы бактерий?
18. Каков механизм генетических рекомбинаций?
19. Что такое трансформация?
20. Что такое трансдукция и какими свойствами обладает трансдуцирующий фаг?
21. Что такое конъюгация бактерий? Как она осуществляется?
22. Как производят картирование хромосом?
23. Что такое плазмида?
24. Какие известны классы плазмид?
25. Каковы основные свойства плазмид?
26. Какие существуют типы генетического контроля лекарственной устойчивости у бактерий?
27. Каковы основные функций F-фактора?
28. В чем заключается механизм конъюгации бактерий?
29. Что такое бактериоцины?
30. Каковы основные свойства Соl -плазмид?
31. Какими свойствами обладают R-плазмиды?
32. Как определяют конъюгативные свойства плазмид?
33. Как получают рекомбинантные молекулы ДНК?
34. Что такое генетический вектор?
35. Как у бактерий можно обнаружить плазмиды?
36. В каких направлениях могут быть использованы достижения генной инженерии?
ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ 10
Определение понятия ген
Ген – универсальная организующая структурная единица живой материи, которая благодаря содержащейся в ней закодированной информации обеспечивает единство и многообразие всех форм существования жизни, ее непрерывность и эволюцию.
Ген – основной носитель и хранитель жизни, а его продукт – белок – способ её существования.
Дата: 2019-03-05, просмотров: 257.
