Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, которые играют важнейшую роль в обмене веществ, регулируя био­химические процессы. Они синтезируются микрофлорой, высшими растениями и поступают в почву с их прижизненными выделениями, после отмирания и лизиса микробных клеток и растительных остатков. Ферменты, выделяемые в почву, значительное время сохраняют активность благодаря фиксации (иммобилизации) илистой и пылеватой фракциями почв, ее органическим веществом.

Ферментативная активность почв определяет интенсивность и направленность биохимических процессов, от которых зависит плодо­родие почвы, и является одним из важных показателей ее биологической активности.

На активность ферментов в почве влияют различные факторы, ингибирующие или активизирующие их действие. Активность ферментов в почве зависит от ее физико-химических свойств, засоленности, карбонатности, окультуренности, внесения удобрений, известкования.

Определение активности ферментов важно для оценки влияния агрохимических средств (традиционных и нетрадиционных органических и минеральных удобрений и химических мелиорантов) на биологическую активность почвы без привлечения специальных микробиологических методов, чтобы судить о мобилизации органических соединений азота, фосфора, серы и др. для питания растений. Ферментативную активность почвы определяют с помощью традиционных химических методов.

По характеру катализируемых процессов ферменты делятся на 6 классов: оксидоредуктазы, гидролазы, лиазы, трансферазы, изомеразы и синтетазы. С тачки зрения агрохимии наиболее интересны первые две группы. Активность оксидоредуктаз характеризует окислительно-вос­становительные условия в почве, активность гидролаз - интенсивность процессов минерализации органических веществ, в состав которых входят важнейшие питательные элементы - азот, фосфор и некоторые другие. Активность фермента выражается в единицах ферментативного действия, что отражает количественные изменения, производимые ферментом в субстрате в определенный отрезок времени при строго определенных условиях - концентрации субстрата, рН, температуре и некоторых других условиях. Существует шкала для оценки степени обогащенности почв ферментами

ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ

Ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, катализируют окислительно-восстановительные реакции, играющие ведущую роль в биохимических процессах в клетках живых организмов и в почве.

Активность окислительно-восстановительных ферментов находит­ся в корреляционной зависимости с основными физико-химическими свойствами, микробиологическими процессами в почве, нитрификацией, сульфофикацией.

Катализа

(Н₂0₂: Н₂О_гоксидоредуктаза.)

Катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород: 2 Н₂0_: -> 2 Н₂0 + 0₂

Перекись водорода образуется в процессе дыхания растений и в результате биохимических реакций окисления органических веществ.

Роль каталазы в почве заключается в разрушении ядовитой для растений перекиси водорода.

Методы определения каталазной активности почв основаны на измерении скорости распада перекиси водорода при взаимодействии ее с почвой.

А скорбинатоксидаза (L-аскорбинат : кислород-оксидоредуктаза. КФ 1.10.3.3)

В основе метода лежит использование редуцирующих свойств аскорбиновой кислоты. Определение активности сводится к установ­лению остаточного количества аскорбиновой кислоты после взаимо­действия почвы с субстратом. Разность между количеством аскорбиновой кислоты, внесенной в почву, и оставшейся неиспользованной после инкубирования с почвой эквивалентна количеству образующейся де-гидроаскорбиновой кислоты.

Дегидрогеназы (Субстрат: НАД(Ф)-оксидоредуктаза. КФ 1.1.1)

Дегидрогеназы - ферменты, участвующие в процессе дыхания. Они отщепляют водород от окисляемых субстратов. Одни дегидрогеназы могут переносить водород непосредственно на молекулярный кислород, другие - только на какие-либо иные акцепторы, например метиленовую синь. Дегидрогеназы катализируют дегидрирование органических веществ и выполняют роль промежуточных переносчиков водорода. При этом субстратами дегидрирования могут быть различные углеводы, органические кислоты, аминокислоты, гуминовые кислоты и т. д. В почве активно действуют дегидрогеназы углеводов и органических кислот. Отщепляемый в процессе дегидрирования водород может передаваться кислороду воздуха (аэробные дегидрогеназы) или органическим веществам типа хинонов (анаэробные дегидрогеназы). Активность де-гидрогеназ является показателем жизнедеятельности микроорганизмов и количества гумусовых веществ, поддающихся разложению микробами.

При определении активности дегидрогеназ в качестве акцептора водорода применяют соль 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый (ТТХ). При этом бесцветные соли тетразолия восстанавливаются в красные соединения трифенилформазана (ТФФ).

Нитратредуктаза (восстановленный НАД: нитрат-оксидоредуктаза. КФ 1.6.6.1)

Процессы восстановления нитратного азота в почве до аммиака катализируют ферменты нитратредуктаза и нитритредуктаза. Нитрат­редуктаза действует как донор водорода и переносит его к кислороду нитратов. В результате действия нитратредуктазы нитраты превращаются в нитриты: НАД ■ Н₂ + NO_} = НАД + N0₂ + Н₂ О.

Метод определения активности нитратредуктазы в почве основан на учете уменьшения количества нитратного азота при анаэробной инкубации почвы.

Ферриредуктаза (восстановленный НАД(Ф): Fe₂0₃ -оксидоредуктаза. КФ 1.6.99)

 Метод основан на учете количества образующегося двухвалент­ного железа при взаимодействии окиси железа с почвой.

Сульфатредуктаза (НАД ■ Н₂: сульфат-оксидоредуктаза. КФ. 1.8.3)

Сульфатредуктаза катализирует восстановление сульфатов до сульфитов: Метод основан на учете уменьшения количества сульфатов в почве после анаэробной инкубации ее с субстратом (сернокислым натрием).

ГИДРОЛАЗЫ

Гидролазы представлены весьма обширной группой ферментов. Наибольшее значение имеют те из них, которые расщепляют сложно-эфирные, глюкозидные, пептидные, кислотно-ангидридные и некоторые другие связи в органических соединениях. Участвуя в реакциях гидро­литического распада высокомолекулярных органических соединений, они играют важную роль в обогащении почвы подвижными и доступными растениям и микроорганизмам питательными веществами.

ПЕПТИД- И ЛМИДОГИДРОЛЛШ В составе растительных остатков и микробных тел в почву поступает значительное количество белковых веществ, аминокислот и других азотсодержащих органических соединений. В превращении этих соединений большую роль играют присутствующие в почве протео-литические и дезаминирующие ферменты. В результате процессов последовательного протеолитического расщепления до аминокислот и распада под действием амидогидролаз и дезаминаз с выделением аммиака, азот белковых веществ превращается в доступную для высших растений форму. Это явление известно как процесс аммонификации.

Протеазы (nenmud-гидролазы) (Пептидил^пептидгидролазы. КФ 3.4.4..}

Протеолитические ферменты катализируют гидролитическое рас­щепление белковых веществ до пептидов и дальнейший гидролиз их до аминокислот. При определении активности протеаз в почве в качестве субстрата обычно применяют казеин, желатин и некоторые пептиды.

Принцип метода основан на учете количества аминокислот, образующихся при протеолизе внесенных в почву белков путем связывания их в окрашенные комплексы.

Аспарагиназа (L-Аспарагин-амидогидролаза. КФ 3.5.1.1)

Аспарагиназа играет важную роль в азотном обмене и наряду с уреазой может отражать динамику азотсодержащих органических со­единений в почве. Она катализирует гидролиз аспарагина, действуя на амидную связь. Аспарагин разлагается аспарагиназой на аспарагиновую кислоту и аммиак:

Метод определения аспарагиназной активности основан на учете количества аммиака, освобождающегося при гидролизе аспарагина в почве.

ОСФОГИДРОЛАЗЫ

Аденошнтрифосфатаза (АТФ фосфогидролаза. КФ 3.6.1.3)

АТФаза катализирует гидролитическое расщепление АТФ на АДФ и ортофосфорную кислоту: АТФ -+АДФ + Н₃Р0₄

Метод основан на количественном учете фосфорной кислоты, отщепленной в результате ферментативной реакции при взаимодействии АТФ с почвой.

Фосфатазы

(фосфогидролазы моноэфиров ортофосфорной кислоты. Щелочная фосфатаза. КФ 3.1.3.1. Кислая фосфатаза. КФ 3.1.3.2)

Фосфатазы относятся к группе ферментов, катализирующих гидролиз ортофосфорных эфиров различных спиртов и фенолов, фосфор-органических соединений, составляющих от 20 до 80% всех запасов фосфора почвы. Посредством воздействия фосфатаз происходит био­химическая мобилизация органического фосфора, он переводится в доступное для растений состояние. Гидролиз идет по фосфорноэфирным связям с отщеплением остатков ортофосфорной кислоты.

Методы определения активности почвенных фосфатаз основаны на количественном учете отщепленного при ферментативной реакции неорганического фосфора или органической части молекулы субстрата -фосфорорганического соединения.

44. Методы идентификации возбудителей болезней растений (метод микроскопического анализа) и интенсивности поражения.

Эпифитные микроорганизмы, развивающиеся на поверхности стеблей, листьев и семян растений (микроорганизмы филлосферы), и микроорганизмы, развивающиеся на корнях растений (микроорганизмы ризопланы), можно наблюдать с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). На препаратах, приготовленных из семян, листьев и корней растений, можно проследить за развитием микроколоний бактерий, дрожжей, грибов, выявить особенности прикрепления микробов к поверхности растительных тканей Электронный микроскоп используется для наблюдение за симбиотическими взаимоотношениями низших растений — водорослей и гетеротрофных микроорганизмов — грибов и актиномицетов. Взаимодействие грибов и водорослей приводит к образованию лишайника (рис.23). В лаборатории при совместном выращивании актиномицета и зеленой водоросли хлореллы образуется актинолишайник, таллом которого напоминает таллом природных лишайников, состоящих из грибов и водорослей. В природе развитие альгоактиномицетных ассоциаций наблюдается на выходах карбонатных пород

Наблюдения за взаимоотношениями в культурах простейших с бактериями. Почвенные простейшие питаются избирательно различными бактериями. Для демонстрации этого явления выделяют чистые культуры наиболее распространенных и характерных почвенных простейших: из жгутиконосцев, например Воdо, амеб, инфузорий — Colpoda. Для получения чистых культур простейших их культивируют на массе клеток Azotobacter chroococcum, Азотобактер — хороший пищевой источник для протистов. Взаимоотношения между азотобактером и почвенными простейшими сложны и включают не только истребление одного организма другим, но и элементы симбиоза. Эксперименты по влиянию простейших на фиксацию азота и интенсивность развития азотобактера проводят в смешанных культурах бактерий и простейших. Выращивают простейшие путем повторных пересевов их в культуру азотобактера на элективной среде Федорова, что позволяет освободиться от посторонних бактерий.

Опыт проводят в течение 7—10 дней при 26°. Плотность популяции азотобактера определяют методом разведений, подсчет простейших в жидких средах проводят микроскопически.

Методы исследования взаимоотношений почвенных беспоз-воночных с макро- и микромицетами. Почвенные беспозвоночные животные питаются грибами, причем отношения их могут быть различными. Мицелий гриба может служить единственным источником питания для животного длительное время, либо мицелий может служить в качестве части пищи животного, либо мицелий губительно влияет на животное.

Для выяснения взаимоотношений между коллемболами, энхитреидами, дождевыми червями, с одной стороны, и грибами — с другой, в чашки Петри с сусло-агаром и культурой гриба "подсаживают" животных. Затем прослеживают поведение животных на культуре грибов. Отмечают степень поедаемости мицелия, подвижность животных, возможность завершения цикла и рост (линьки), смертность животных.

Дождевые черви и энхитреиды, как правило, не употребляют в пищу высших грибов. Коллемболы и личинки двукрылых активно питаются мицелием многих грибов.

Для исследования возможности распространения мицелия и спор грибов с экскрементами животных последних стерилизуют стрептомицином с поверхности и пересаживают в чашки Петри со стерильным сусло-агаром. Затем прослеживают рост грибов на. питательной среде. Споры Penicillium и Fusarium oxysporus, попадая в кишечник вместе с гифами в процессе питания, активно переносятся животными через экскре-менты. Споры Alternaria tenuis перевариваются в кишечнике коллембол и личинок двукрылых сем. Sciaridae. Опыты по пересадке животных с отмытой, но не простерилизованной поверхностью тела показали, что мицелий грибов активно распространяется животными.

Взаимоотношения водорослей и почвенных беспозвоночных животных. При выращивании водорослей на мембранных фильтрах, помещенных на почву, отмечается поселение простейших, в частности амеб, клещей, энхитреид. Уменьшение количества водорослей на фильтрах или полное их исчезновение в результате выедания заметно макроскопически.

Опыт по выявлению выедания почвенных водорослей энхитреидами проводят следующим образом. Количество энхитреид в почве учитывают путем тщательного просматривания под бинокулярной лупой.

Методы исследования взаимоотношений почвенных беспозвоночных с микроорганизмами. Для определения характера связей почвенных мик-роорганизмов и беспозвоночных, выявления симбиотических и антагонистических отношений между ними изучают микроорганизмы в кишечниках, пище, экскрементах животных. Правильные сравнительные результаты получают только при равномерной заполненности кишечников животных пищей, т. е. в период активного насыщения. Пустые кишечники исследуют в случае изучения облигатного симбиоза — специфической микрофлоры пищеварительного тракта или внутриклеточных симбионтов.

Объектами микробиологического анализа при изучении зоомикробных взаимоотношений являются : пищевой субстрат беспозвоночных (листовой или хвойный опад, компост, почва и др); содержимое кишечника животных; поверхность кишечного эпителия; специализированные органы и ткани (мицетомы, клетки эпителия и др.); экскременты; поверхность тела и конечностей животных.

Для изучения микроорганизмов, находящихся на поверхности тела животного, делают смыв с нее и высевают на плотные питательные среды.

Для анализа микроорганизмов содержимого кишечника используют "сытых" особей, т.е. животных, нормально питающихся до начала посева

Одновременно анализируют две группы по 5 особей. Животных обездвиживают в кипятке в течение 1-2 с и вскрывают в стерильных условиях.

Животных вскрывают стерильным скальпелем, отделяют и извлекают кишечники. При малых размерах животных не выделяют их кишечники. В этом случае из тел беспозвоночных с отмытой и простерилизованной поверхностью тела приготовляют гомогенат, который затем высевают на среду.

Кишечник разделяют на отделы – передний, средний и задний, каждый из которых стерильно вскрывается при помощи иглы под контролем в бинокулярной лупе. Из кишечника достают содержимое и помещают на влажную стерильную фильтровальную бумагу. Содержимое кишечников 5 –ти особей взвешивают (параллельно определяют влажность содержимого, высушивая его при 1050), добавляют 2 капли стерильной воды и растирают в ступке пестиком с резиновым наконечником. Для анализа микроорганизмов, адсорбированных на кишечном эпителии, используют "голодных" особей. Животных отсаживают с опада на несколько суток на влажную фильровальную бумагу для освобождения кишечника от содержимого. Кишечник стерильно изолируют и разделяют на отделы, не вскрывая. Каждый отдел прополаскивают последовательно в трех порциях стерильной воды. Материал от 5 особей собирают в бюксы, взвешивают и растирают в агатовой ступке с 2 каплями воды пестиком с резиновым наконечником. Параллельно определяют влажность образцов. В ступку добавляют 2 мл стерильной воды и гомогенат доводят до 3 мл. Для посева берут 25-100 мкл гомогената. Иногда используют 10-кратные разведения гомогената.

45.  Фитопатологическая экспертиза (метод рулонов).

Метод рулонов – используется в лаборатории. Полосы фильтровальной бумаги размером 96х16 см нумеруют, погружают в водопроводную воду и развешивают для стекания воды. Зерна, например, пшеницы тщательно моют, поверхностно дезинфицируют, промывают стерильной водой и раскладывают рядами на бумажные полосы из расчета 80-100 зерен на одну полосу. Примерно на 1 см выше семян помещают полоски агара шириной 1см, заросшие штаммом фитопатогена и накрывают увлажненной полимерной пленкой. За счет этого сдерживается разрастание корней по фильтровальной бумаге. Готовую полоску скручивают в рулон. Нижний его край загибают примерно на 1 см и зажимают двумя скрепками, верхний конец остается открытым. По несколько рулонов ставят в пленочные пакеты с отверстиями для вентиляции и пакеты размещают в проволочных корзинах. Примерно через 4 недели из верхнего конца рулона вырастают растения. Рулоны разворачивают и проводят оценку растений по выраженным симптомам.