Принцип метода. Мокрое озоление органических соединений почвы хромовой смесью проводят в колбах на электрической плитке. О количестве углерода, содержавшегося в органических соединениях, судят по количеству оставшегося неизрасходованным бихромата калия, которое определяют титрованием солью Мора. Определение углерода органических соединений по Тюрину содержит несколько потенциальных источников ошибок. Во-первых, полнота окисления органического вещества на плитке сильно зависит как от времени сжигания, так и от интенсивности кипения. Во-вторых, определение содержания углерода по остаточному количеству бихромата калия требует приливания к навеске почвы точного количества хромовой смеси. Поэтому эта модификация требует от аналитика особой тщательности проведения всех операций.

39. Методы определения микробиологической активности. Концептуальные основы методов. Методические требования к реализации методов и стандарты.

К микробиологическим методам относятся аппликационные и методы определения численности микроорганизмов.

Фиксация молекулярного азота - одна из главных функций микроорганизмов в биосфере Земли.

Определение интенсивности азотфиксации в конкретных место­обитаниях азотфиксирующих микроорганизмов (диазотрофов), необходи­мое для выяснения размеров поступления «биологического» азота в почвы разных типов, - важная задача почвенной микробиологии. Активность азотфиксации является одним из интегральных показателей биологической активности почв и поэтому широко используется для ранней диагностики загрязненности почв тяжелыми металлами, ядохимикатами, ксенобиотиками, применяется при санитарно-гигиеническом нормирова-нии токсических веществ в почве. Способностью к азотфиксации обладают только бактерии. Микро-организмы-эукариоты (грибы, дрожжи, водоросли), а также растения и животные фиксировать молекулярный азот не могут.

Тем не менее, они своей деятельностью создают благоприятные условия для процесса азотфиксации: снабжают бактерии легкодоступ­ными источниками питания, понижают концентрацию кислорода вокруг них, быстро утилизируют связанный ими азот. Поэтому, как правило, азот-фиксация протекает в системах прокариотных и эукариотных организмов, которые и являются основными объектами исследования при изучении азотфиксации в почве.

Актуальная активность измеряется при конкретных сочетаниях экологических факторов для изучаемой системы и характеризует реальную интенсивность процесса в определенный момент времени.

Потенциальная активность измеряется при оптимуме влажности и температуры и при избытке источника питания, вследствие чего является показателем максимально возможного для данной системы уровня азотфиксации.

Ацетиленовый метод

Нитрогеназа - азотфиксируюший ферментный комплекс диазотрофных бактерий - способна восстанавливать не только молекулярный азот до аммиака, но и ряд других соединений, имеющих в молекуле тройную связь, в частности ацетилен. Особенности ацетиленового метода Инкубация с ацетиленом предполагает в качестве обязательного условия быстрое и равномерное перемешивание газов в исследуемой системе. Благодаря хорошей раствори­мости ацетилена в воде это условие хорошо выполняется для водных и песчаных культур растений, для почв легкого механического состава. Более сложно протекает газообмен в почвах тяжелого механического состава и в переувлажненных почвах, что приводит к недооценке реальной интенсивности азотфиксации. Одним из способов усиления газообмена является принудительная подача ацетилена в толщу почвы.

Длительность инкубации с ацетиленом оказывает значительное влияние на результаты определения азотфиксации. Так, при длительной (более 2 ч) инкубации наблюдаются значительные отклонения коэффи­циента пересчета от теоретического. Произвольное увеличение времени инкубации в атмосфере ацетилена - наиболее распространенная ошибка при использовании ацетиленового метода. Чаще всего прибегают к этому в попытке повысить чувствительность обнаружения этилена, особенно при низкой интенсивности азотфиксации. Нередко образцы инкубируют в течение 12 - 24 ч и более. Следовательно, первым общим правилом при использовании ацетиленового метода является сведение к минимуму времени инкубации азотфиксирующих систем в атмосфере ацетилена: в зависимости от конкретных задач исследования время инкубации может составлять от 15-30 мин до 1 - 1,5 ч и не должно превышать 2 ч. Второе условие -контроль за неспецифическим образованием этилена. Этилен образуется многими почвенными грибами и бактериями, выделяется корнями растений, постоянно присутствует в техническом ацетилене. Он нередко обнаруживается в воздухе лабораторных помещений, где источниками его являются пламя газовых горелок и спиртовок, а также разрушающие­ся на свету или при нагревании резина и полиэтилен.

В почве интенсивность неспецифического этиленогенеза зависит от ее свойств: почвы, богатые органическим веществом, выделяют этилен в наибольших количествах. Повышенному образованию этилена способ­ствует избыточное увлажнение. Напротив, азотные удобрения, соедине­ния железа и марганца тормозят этиленообразование в почве.

Среди других причин, влияющих на точность результатов при применении ацетиленового метода, выделяются следующие:

1. Этилен, являясь мощным гормоном растений, может существенно менять их метаболизм, что в свою очередь будет влиять на активность азотфиксации у симбиотических и ассоциативных микроорганизмов.

2. Отсутствие механизма «обратной связи» при использовании ацетилена в качестве субстрата для нитрогеназы может быть причиной завышения реальной интенсивности азотфиксации.

3. Постоянная высокая насыщенность почв молекулярным азотом предопределяет отсутствие торможения азотфиксации из-за дефицита субстрата для нитрогеназы. В то же время затрудненное проникновение ацетилена в микрозоны почвы может стать причиной существенной недооценки реальной интенсивности азотфиксации.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ДЕНИТРИФИКАЦИИ В ПОЧВЕ

Денитрификация - микробиологический процесс, играющий важную роль в азотном балансе почв. Существуют различные приемы оценки денитрифицирующей активности почвы. Широко известным способом определения активности денитрификации в почве является метод балансовых расчетов с определением концентрации азота в почве перед началом инкубации почвы и после ее окончания. При этом пользуются традиционными методами определения азота в почве (метод Кьельдаля), что делает определение очень трудоемким, непроизводитель­ным и малопригодным для массовых анализов. Способ определения денитрифицирующей активности почвы путем измерения концентрации нитратов в почве с помощью ионоселективных электродов является производительным, но малочувствительным методом, что делает опре­деление активности денитрификации в почве неточным. Самым распространенным приемом для оценки денитрифицирую­щей активности почвенных микроорганизмов является метод, основан­ный на использовании ацетилена в качестве ингибитора редуктазы закиси азота, что позволяет судить об активности процесса по накоплению закиси азота (N20) в газовой фазе. Этот метод позволяет определять активность денитрификации у чистых культур микроорганизмов и в почве.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРИФИЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВЫ

Активность протекания нитрификации является важным показате­лем микробиологического состояния почвы. Высокая нитрифицирующая активность характерна для окультуренных почв, в которых достаточное содержание азота, хорошая аэрация, реакция среды близка к нейтральной. Эти условия благоприятны для роста большинства сельскохозяйственных растений, и поэтому интенсивность нитрификации указывает на хорошую окультуренность почвы. Вместе с тем активное протекание нитрификации в почвах крайне нежелательно, так как ведет к потерям азота в форме нитратов, вымывающихся из почвы в фунтовые воды, газообразных соединений и к повышению содержания нитратов в сельскохозяйственной продукции.

Один из подходов в изучении процесса нитрификации заключается в компостировании почвы и измерении количества образовавшихся нитратов. Существуют различные модификации метода компостирования для определения нитрифицирующей способности почвы.

В изложенной методике проведено уточнение ряда параметров (количество вносимого азота, длительность, инкубации), она позволяет определить вклад автотрофных и гетеротрофных нитрифицирующих микроорганизмов в образование нитратов, изучать газовую фазу над почвой. Метод можно использовать для массовых анализов.

40. Методы диагностики вредного влияния сорняков: методы измерения биомассы, засоренности почвы семенами, токсического влияния выделений сорных растений. Концептуальные основы методов. Методические требования к реализации методов и стандарты