Метод посева из разведений почвенных суспензий на плотные питательные среды является не единственным и не самым совершенным для количественного учета микроорганизмов в почве. Число бактерий, например, учитываемое с помощью прямого метода люминесцентного микроскопи-рования почвенной суспензии, в 1000 раз превышает количество бактерий, учитываемое методом посева. Однако метод посева остается одним из распространенных в практике исследования почвенных микроорганизмов вследствие того, что позволяет учитывать не только численность, но и таксономический состав комплекса почвенных микроорганизмов. Из изолированных колоний, вырастающих на чашках с питательной средой, можно выделять чистые культуры микроорганизмов для дальнейшего исследования и идентификации

Методы получения чистых культур и культивирования почвенных микроорганизмов

Чистой культурой микроорганизма называют культуру, представляющую собой потомство одной клетки. В случае нитчатых или мицелиальных организмов чистая культура может быть подучена из многоклеточной нити.

При посеве почвенной суспензии на поверхность плотных сред на чашках Петри получаются изолированные друг от друга колонии микроорганизмов. Для получения чистой культуры материал, взятый петлей из отдельной колонии, переносят в свежую питательную среду и равномерно распределяют шпателем по поверхности. После этого тем же шпателем, не обжигая его, засевают последовательно еще 2—3 чашки. Обычно на первой чашке после 16 определенного срока инкубации наблюдается густой, а иногда и сплошной рост микроорганизмов, а на последующих образуются хорошо изолированные друг от друга колонии. Путем отсева из этих колоний получают чистые культуры. Чистоту выделенной культуры проверяют следующим методом: рассевают культуру истончающимся штрихом на поверхность плотной среды, следят за характером и однородностью роста колоний, контролируют микроскопически.

Культивирование микроорганизмов требует определенных условий температуры, аэрации, рН среды. Постоянная температура поддерживается в термостатах. Термостатами могут быть специальные шкафы, существуют и специальные термостатные комнаты. Мезофильные организмы выращивают при температурах 25— 35°, термофильные — 50—60°, психрофилы — 0—20°. Водоросли и фотосинтезирующие бактерии инкубируют в термостатах с ис-кусственным освещением — люминостатах.

Аэробные микроорганизмы культивируют на поверхности питательных сред в чашках Петри, в колбах и матрасах или в глубине жидких сред, снабжая последние необходимым для микробов количеством кислорода путем встряхивания или перемешивания культур на качалках или пропускания струи стерильного воздуха через толщу среды.

Для получения больших количеств биомассы или культуральной жидкости микроорганизмов используют специальные аппараты — ферментеры, оборудованные для перемешивания среды, подачи и распределения воздуха, а также имеющие контрольно-измерительные приборы, регистрирующие температуру, давление, концентрацию субстрата и продуктов обмена, скорость тока воздуха, ОВП, рН среды.

При культивировании анаэробов из среды и окружающего пространства удаляют кислород. Для этого перед использованием среду кипятят. После высева среду заливают слоем масла или вазелина. Плотную питательную среду заливают слоем полужидкого агара (0,1%). К средам добавляют редуцирующие вещества – тиогликолят натрия, редуцирующие сахара, восстановленное железо. Для инкубирования в анаэробных условиях чашек Петри, засеянных 17 анаэробными микроорганизмами, используют специальные сосуды - вакуумные эксикаторы, из которых откачивают воздух, пока давление не упадет до 500 мм рт.ст., и заполняют эксикатор инертным газом, например азотом, водородом или их смесью с примесью 5-10% СО2; анаэростаты, из которых откачивают воздух и заполняют водородом; сосуды с генераторами Н2+СО2.

Для учета представителей почвенных беспозвоночных животных в поле или в лесу используется метод выборки животных из почвы. Простой способ выборки – метод почвенных раскопок. Размер выбираемой пробной площадки зависит от степени увлажненности почвы, чаще всего 0,25 м2, в сухих районах до 1 - 2 м2. Расстояние между раскопками, которых может быть несколько – 5 - 10 м. Раскопки делают на глубину 30 - 50 см, в сухих местах на легких почвах – до 100 см и более.

Почву из раскопки выбирают послойно. От границ отмеренной площадки отгребают опад или подстилку (если площадка в лесу) или сухую землю поверхностного слоя (на пару). Рядом с площадкой помещают клеенку или плотную материю, на которую выкладывают выбранную из раскопкой почву. Каждый вынутый слой почвы, в том числе и слои подстилки, тщательно вручную перебирают, собирая животных отдельно из каждой пробы и слоя. Дождевых червей и моллюсков помещают в мешочки или банки с почвой. Хищников помещают поодиночке. Мелких насекомых, многоножек, мокриц помещают в пробирки с 700-ным спиртом с добавлением нескольких капель глицерина и формалина, крупных насекомых – в морилки или сосуды со спиртом. Собранный и зафиксированный материал подлежит систематической обработке для определения видовой принадлежности. В зоологической литературе имеются специальные определители, которыми пользуются для идентификации.

Для учета мелких членистоногих пробы можно брать на свежезачищенной стенке траншеи или почвенного разреза методом смешанных образцов. В этом случае исследуется погонный метр траншеи, разделенный на 5 колонок. В каждой из колонок из середины почвенных горизонтов берут мелким буром по 5 точечных образцов, объединяемых затем в одну смешанную пробу объемом 150 см3 (объем бура 30 см3). Численность микроартропод выражают числом экземпляров особей в слое или в 1 г почвы.

Для учета личинок насекомых (хрущей, щелкунов, крупных видов долгоносиков и мух) используют сельскохозяйственную обработку почвы плугом. Личинки собирают в борозде и учитывают. Количество животных за плугом пересчитывают на каждый погонный метр.

Для учета проволочников используют метод приманок – животных улавливают на приманки из ломтей картофеля, натыкаемых на палочки и закапываемых в почву на глубину около 5 см на расстоянии 50 – 100 см друг от друга. Для учета гусениц на полях пропашных культур и на парах раскладывают кучки выполотых сорняков или скошенной травы, служащие приманками. Под каждой такой кучкой в местах с высокой плотностью залегания этих вредителей скапливается иногда до нескольких десятков особей. Проверку и подсчет гусениц проводят в ранние часы на следующее утро после раскладки.

Для учета дождевых червей в почве кроме метода выборки используют также метод полива поверхности почвы раздражающими покровы червей жидкостями, заставляющими червей выходить на поверхность. Используют 0,14-0,5% раствор формалина.

Для учета нематод (см. Приложение) в почве применяют метод с "воронкой Бермана". Воронку вставляют носиком в пробирку, затем всю установку помещают в сосуд с водой так, чтобы воронка была почти доверху наполнена водой. В воронку на сите помещают пробу почвы (1см3 или 1г) так, чтобы почва оказалась погруженной в воду. Нематоды проползают через ячейки сита и скатываются в пробирку. Подсчет животных проводят через сутки на часовом стекле или в специальной камере.

42. Методы исследования биологической активности почв (метод определения дыхания почвы)

Почвенный воздух имеет большое значение для почвенных процессов и роста растений. Он участвует в химических и биохимических процессах, протекающих в почве, оказывает влияние на окислительно-восстановительные условия в почве, ее реакцию и растворимость хими­ческих компонентов. Почвенный воздух важен для углеродного питания растений (более половины углекислого газа, идущего на формирование урожая сельскохозяйственных культур, потребляется растениями из почвы)- Его состав изменяется во времени и по профилю почвы, зависит от внесения органических и минеральных удобрений, вида растений, биологической деятельности почвы, гидротермических условий и т. д.

В результате биологических процессов в почве поглощается кислород и выделяется углекислый газ, который идет на образование безазотистых органических веществ - углеводов:

6 СО_: + 6 Н₂0 + 674 ккал -> С₆Н120₆ + 6 0₂.

Выделение углекислого газа из почвы в атмосферу в процессе диффузии зависит от продуцирования С0₂ почвой, ее физических и химических свойств, гидротермических условий. Решающая роль в продуцировании углекислого газа почвой принадлежит биологическим факторам, поэтому выделение С0₂ из почвы может характеризовать интенсивность биологических процессов в ней.

Газовый режим почвы складывается из следующих показателей: содержания воздуха в почве, его состава, аэрации и интенсивности выделения газов (С0₂, N ₂ O_t N 0₂, NH ₃ ). Определения проводят каждые 15 дней или приурочивают к фазам развития растений. Одновременно ведут наблюдения за давлением и температурой воздуха и почвы.

Все методы определения дыхания почвы можно разделить на 3 группы:

1. Методы обогащения С0₂ в изолирующем устройстве (колоколе и др.): определяются начальная и конечная концентрации С0₂ в воздухе изолятора, установленного на поверхности почвы (Макаров, 1957).

2. Методы проветривания: ток воздуха протягивается через изолятор (колокол, цилиндр), поставленный на поверхность почвы, и углекислый газ непрерывно поглощается.

3. Методы абсорбции: под изолятор над почвой помещается сосуд со щелочью, которая непрерывно адсорбирует С0₂ (Штатное, 1952).

Упрощенные методы определения интенсивности дыхания ночвы основаны на учете количественных изменений углекислого газа в окружа­ющем воздухе с помощью широкогорлых конических колб (Маштаков и др., 1954; Макаров и др., 1957).

Метод «колб» имеет недостаток. Так как дыхание почвы происходит в замкнутом пространстве, внутри колбы уменьшается парциальное давление кислорода и нарушается газообмен.

А.Ш. Галстян предложил для устранения этого недостатка со­единить колбу, где происходит дыхание почвы, с наружным воздухом с помощью трубки с натроновой известью.

Адсорбционый метод определения углекислого газа, выделив­шегося из почвы, позволяет вести наблюдение непосредственно в поле сразу на нескольких вариантах опыта. Эти методы предложены Штатно-вым, Миной и Карпачевским.

Недостаток применяющихся вариантов метода Штатнова и Мины в том, что они не учитывают двух факторов, влияющих на результат определения.

1. При отсутствии перемешивания жидкости в поглотителе сорбция С0₂ щелочью быстро затухает.

2. Поглощение С0₂ зависит от площади поглотителя; так как расчет в адсорбционном методе Штатнова ведется на изолированную площадь, то чем меньше площадь поглотителя, тем меньше получается интенсивность выделения С0₂. В.Н. Мина рекомендовал брать поглотитель с площадью, близкой изолированной поверхности почвы. Однако расчет выделения

Определение интенсивности выделения углекислого газа из почвы (метод Галстяна)

Метод основан на определении интенсивности дыхания почвы по учету количественных изменений углекислого газа в атмосфере почвы с помощью широкогорлых конических колб. 10 г свежей почвы в марлевом мешочке подвешивают за крючок в пробке (при анализе влажной почвы используют металлические корзинки). В плоскодонную колбу на 250 см³ наливают 25 см³ 0,025 М раствора гидрата окиси бария. Колбу закрывают пробкой с мешочком и помещают в термостат при температуре 28 - 30°С на 24 ч.

Одновременно с опытными колбами ставят контрольные с гидратом окиси бария, но без почвы для учета углекислого газа воздуха в колбе. Колбы периодически встряхивают для разрушения образовавшейся пленки карбоната бария. После экспозиции избыток гидрата окиси бария оттитровывают 0,05 М раствором НС1 по фенолфталеину. По разнице между данными титрования контрольной и опытной почвы определяют количество выделившегося углекислого газа.

Интенсивность продуцирования выражают в миллиграммах угле­кислого газа, выделившегося за сутки на 100 г почвы.

Определение содержания выделившегося С0₂ по Карпачевскому

Этот метод позволяет определить углекислый газ, выделившийся из почвы непосредственно в полевых условиях.

Ход анализа

Стеклянные стаканчики на 50 см³ диаметром 4 - 6 см (измерить микрометром для последующего расчета площади поверхности жид­кости). Приливают пипеткой 2 см³ 0,1 М раствора КОН. Стаканчики ставят на поверхность почвы опытного участка, секундомером отмечают время начала опыта.

Через 20 мин раствор в стаканчиках оттитровывают из микро­бюретки 0,05 М H₂S0₄ по фенолфталеину.