Определение содержания белков, жиров, углеводов, витаминов

Мокрое озоление растительного материала по Гинзбург и определение азота, фосфора, калия из одной навески.

В основу метода положены реакции гидролиза и окисления органических веществ растений смесью серной и хлорной кислот в со­отношении 10:1 при нагревании. Основным окислителем является хлорная кислота (НСlO4).

Безазотистые органические вещества окисляются до воды и угле­кислоты, высвобождая зольные элементы в виде оксидов. Азотсодержа­щие органические соединения гидролизуются и в конечном счёте, окисляются до воды и углекислоты, освобождают азот в виде аммиака, который немедленно связывается серной кислотой.

Таким образом, в растворе находятся зольные элементы в виде оксидов и азот в форме сернокислого аммония и аммонийной соли хлорной кислоты.

Метод мокрого озоления исключает потери азота, фосфора и калия в виде их оксидов, так как растительное вещество озоляется при температуре 332°С. Это температура кипения серной кислоты, у хлорной кислоты значительно меньшая температура кипения - 121 °С.

Необходимо помнить, что при добавлении избытка хлорной кислоты в процессе озоления происходят значительные потери азота (до 50%).

Метод Кьельдаля: навеску озоляют в колбе конц. H2SO4од действием кат. Se,H2O2темп-332С. N сохр-ся в виде сульфата аммония.Для освобождения NH3 исп-ют 40% р-р щёлочи.Отгон аммиака ведут в аппарате Кьельдаля. NH3 не теряется,а попадает в приёмник с титрованной серной кислотой,образуя сернокислый аммоний. Изб. к-ты не связанный с NH3 оттитровывают щёлочью.

В растительных тканях содержание белков обычно ниже, чем содержание углеводов, тем не менее по значимости белки являются главным компонентом растительных клеток, так же как клеток бактерий и животных.

Принцип метода. Методы определения белкового азота включают выделение белка из общей растительной массы. Для этого белок переводят в осадок, а небелковые азотистые соединения, хорошо растворимые в водных растворах, отмывают водой или слабым раствором осадителя.

Отмытый и подсушенный белок сжигают в концентрированной серной кислоте, при этом получаются следующие продукты окисления: Н20, СО2, SO₄' из сульфгидрильных групп белка, a NH2 превращается в NH₄, образуя растворимую соль, которая сохраняется в колбе. Получен­ный азот в виде аммиака отгоняют в аппарате Кьельдаля и результаты пересчитывают на белок.

Осаждение белка из раствора проводят одним из следующих реактивов: уксуснокислым свинцом (СН3СОО)2РЬ, медным купоросом CuS04 ■ 5Н20, натрием сульфосалициловым, трихлоруксусной кислотой, фосфорновольфрамовой кислотой и др.

Определение крахмала в зерне на поляриметре по Эверсу

Крахмал - углевод, входящий в группу полисахаридов второго порядка, представляет собой вещество с большим молекулярным весом, нерастворим в воде, но дает коллоидные растворы.

Крахмал, который образуется в вегетативных органах растений в процессе фотосинтеза, называется ассимиляционным, количество его измеряется несколькими процентами, основная же масса крахмала откладывается в запас в некоторых органах: в семенах, клубнях, корне­клубнеплодах - и называется запасной. Особенно богаты крахмалом семена злаков (50-70% сухого веса) и некоторые корнеплоды (10-30% сырого веса).

Для определения крахмала используют методы кислотного гидро­лиза, которые основаны на разложении крахмала до декстринов, а затем до глюкозы. Полученная глюкоза впоследствии количественно учитыва­ется химическим методом Бертрана или определяется на поляриметре. Первый метод пригоден для определения крахмала в листьях, стеблях и корнях, т.е. в экстрактах, окрашенных растительными пигментами, а на поляриметре определяют глюкозу в бесцветных вытяжках, полученных при анализе зерна или слабопигментированных корнеплодов. Этот метод является наиболее быстрым из многих, предложенных ранее, и широко применяется в настоящее время.

Принцип метода состоит в гидролизе крахмала слабой кислотой и в определении угла вращения гидролизата на поляриметре. Удельное вращение гидролизатов [а]р из семян различных культур в среднем принимают равным 181. Для очень точных расчетов этот показатель уточняют по специальным руководствам для определенной культуры: пшеницы, ржи, риса, проса и т.д. Зерно размалывают на мельнице и просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм. Отруби тщательно растирают в ступке и смешивают с мукой, если определение крахмала ведется в эндосперме.

Определение общего содержания жира

Для ускорения процесса экстракции жира из растительной пробы необходимо измельчение материала, но не очень тонкое. Обычно материал с низким содержанием жиров (до 10%) зерновые и вегетатив­ные органы - размалывают на мельнице «Пируэт» и пропускают через сито в 1 мм без остатка. Измельчение семян с высоким содержанием жиров производить таким образом нельзя из-за больших потерь масла при размоле. Поэтому такие пробы тщательно растираются в фарфоровой ступке. Предварительно растирают небольшое количество исследуемого материала, при этом происходит насыщение поверхности ступки и пестика маслом, а материал выбрасывают.

Рекомендуется брать навеску материала в воздушно-сухом состоя­нии и в отдельной пробе определять абсолютно сухой вес.

Высушивание материала при повышенной температуре допуска­ется только в вакууме или токе индифферентного газа (углекислом газе и водороде), чтобы исключить окисление на воздухе маслянистых веществ и изменение их растворимости.

Избыточное присутствие влаги в анализируемом материале увеличивает извлечение примесей и затрудняет извлечение самого жира.

Для технических целей допускается выполнять анализы с предвари-тельным подсушиванием взятой навески в обычном сушильном шкафу при температуре 100 - 105°С в течение 3 ч. После этого бюкс с навеской охлаждают в эксикаторе и взвешивают на аналитических весах.

Этот способ сушки не пригоден при анализе материалов с высоким процентом жиров и высоким содержанием непредельных жирных кислот.

Экстракцию жира необходимо проводить сразу же после измельче­ния анализируемого материала, чтобы избежать процессов окисления жира. Хранить растертые образцы можно только в токе инертного газа.

Патрон с навеской помещают в экстрактор аппарата Сокслета. Перед определением круглодонные колбы доводят в термостате до постоянного веса, взвешивают на аналитических весах и хранят в большом эксикаторе. Для работы в колбу приливают 2/3 - 3/4 объема сухого чистого эфира (очистку эфира см. далее «Реактивы»).

Соединяют колбу с экстрактором и холодильником. Подготов­ленный аппарат ставят на водяную баню, включают подогрев и холодильник. Нагревание и кипение эфира регулируют так, чтобы каждое сливание эфира из экстрактора в колбу происходило примерно через 6 мин. Как слишком слабое, так и чрезмерно сильное кипение замедляет извлечение жира. Температуру в водяной бане поддерживают на уровне 45 - 50°С.

При кипении пары эфира поднимаются по узкой боковой трубочке, заполняют весь объем экстрактора и поднимаются по шарикам внутрен­ней трубки холодильника. Там пары эфира конденсируются, стекают по трубке вниз, попадая в патрон с навеской или на пакет. Когда уровень эфира поднимается выше верхнего колена сифонной трубочки, эфир с извлеченным жиром стекает в круглодонную колбу. Регулировать темпе­ратуру экстракции можно погружением колбы в водяную баню, снижением водяного охлаждения в воздушном холодильнике, покрытием колбы и сифонов асбестовой тканью. Чтобы капли конденсированной влаги на поверхности холодиль­ника не попадали на шлифы, экстракционную трубку обматывают несколько раз шпагатом, концы которого свободно свисают по стенкам трубки.

При нормальной работе прибора извлечение из образцов с малым содержанием жира обычно заканчивается за 4 - 6 часов, а с большим - за 5-8 часов. Не рекомендуется проводить экстракцию более 12 часов. Конец экстракции определяют следующим образом: отсоединяют колбу, от трубки и на чистое часовое стекло берут несколько капель эфира, стекающего из экстрактора. После испарения эфира стекло должно остаться абсолютно чистым, если на стекле образуется налет -экстракция считается незаконченной. При очень длительной экстракции появление налета является результатом извлечения небольшого количества трудно растворимых в эфире веществ, а не жира.

После окончания экстракции колбу отсоединяют от экстрактора, соединяют с холодильником и отгоняют основную массу эфира на водя­ной бане при температуре 50 - 60°С. Полное удаление эфира из колбы проводят в токе инертного газа: водорода, азота или углекислоты. До постоянного веса колбы сушат в термостате 1 час при температуре 70°С.