Идентификация стафилококков

Целью первичной идентификации является установление принадлежности выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и роду Staphylococcus. Для установления принадлежности культур к семейству микрококков используют тест на каталазу.

Отмечают способность представителей семейства микрококков, имеющих фермент каталазу, расщеплять перекись водорода, образуя воду и газообразный кислород.

В отличие от микрококков представители родственного семейства стрептококков каталазы не имеют.

Видовая идентификация стафилококков

Последним этапом исследования является дифференциация S . aureus от представителей двух коагулазоотрицательных видов стафилококков. Если установлено, что штамм относится к виду S . aureus, проводят его идентификацию.

Идентификация S . aureus

Ориентировочные данные о принадлежности культуры к Staphylococcus можно получить при изучении характера колоний, выросших после посева исходного материала на элективную среду (для стафилококков – молочно-желточный солевой агар).

Определение лецитоветиллазы (лецитиназы)

Хлористый натрий является элективным фактором, так как подавляет рост большинства представителей микрофлоры, главным образом, грамотрицательной. Из компонентов яичного желтка – лецитоветиллаза является субстратом для фермента лецитоветиллазы. При расщеплении лецитоветиллина вокруг лецитиназоположительной колонии на поверхности среды образуется радужный венчик. Добавление в среду молока путем сложных химических процессов стимулирует образование стафилококками золотистого или лимонно-желтого пигмента, относящегося к группе каротиноидов.

Как правило, штаммы S . aureus обладают лецитиназой и пигментом, а культуры двух других видов лишены их. Возможны, однако, исключения: некоторые штаммы S. aureus не имеют пигмента или лецитиназы, а ряд штаммов S . epidermidis обладают лецитиназной активностью.

Реакция плазмокоагуляции

Принцип. Под действием фермента плазмокоагулазы активизируется естественная система свертывания крови (плазминогенротромбин).

Приготовление свежей плазмы. Стерильно взятую из сердца кровь кролика в количестве 3 мл вносят в пробирку с 2 мл стерильного 5 % раствора лимоннокислого натрия, смешивают и центрифугируют для осаждения форменных элементов крови в течение 10 минут при 1500 об/мин.

Плазму отсасывают, разводят в 5 раз стерильным физиологическим раствором и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл.

Ход исследования. В пробирку вносят 1 петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма, которую суспензируют в плазме. Штатив с пробиркой помещают в термостат при 37 °С и регистрируют результаты через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации.

Оценка результатов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Отсутствие свертывания плазмы в течение 18 часов расценивается как отрицательный результат. В качестве контроля рекомендуется ставить реакцию с заведомо коагулирующим и некоагулирующим штаммами, а также оставлять одну пробирку с плазмой незасеянной.

Окончательная идентификация S . aureus требует постановки еще двух тестов. На первом этапе определяют наличие у штаммов плазмокоагулазы. Если после этого штамм идентифицировать не удается, дополнительно определяют один из двух следующих признаков: наличие ДНК-азы (что предпочтительнее) или способность ферментировать маннит в анаэробных условиях.

При наличии положительного результата в реакции плазмокоагуляции и хотя бы в одном из двух предварительных тестов (пигмент лецитиназа) исследуемый штамм может быть отнесен к виду S . aureus (варианты 2-3).

Отсутствие плазмокоагулазы и хотя бы одного из двух первых признаков дает основание считать, что штамм не принадлежит к S. aureus (варианты 5-7).

Расхождения между результатами реакции плазмокоагуляции, с одной стороны, и двух предварительных тестов – с другой (варианты 4 и 8), требует постановки одного из двух дополнительных тестов (ДНК-азы или ферментации маннита в анаэробных условиях). В случае совпадения результатов дополнительного теста с результатами реакции плазмокоагуляции штамм считается либо относящимся к виду S . aureus при положительных результатах (варианты 4а и 4в), либо не относящимся к нему (при отрицательных, варианты 8б и 8г), или отрицательных (принадлежность к другим видам, варианты 4б и 4г) результатов.

Проводить идентификацию S . aureus лишь на основании результата одного теста не рекомендуется.

Определение ДНК-азы

Принцип. Под действием ДНК-азы (дезоксирибонуклеазы) добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная, среда становится прозрачной.