В первый день (1-й этап исследования) в стерильную посуду
(пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Изу-
чают его внешний вид, консистенцию, цвет, запах и другие признаки;
готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых
случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить диа-
гноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться ма-
териал. Посев проводят бактериологической петлей (применяется
чаще всего), с помощью шпателя методом Дригальского, ватно-
марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном,
подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оп-
тимальной температуре (37 °С) на 18−48 ч. Цель этапа – получить
изолированные колонии микроорганизмов.
Однако порой с целью накопления материала его засевают на
жидкие питательные среды.
На второй день (2-й этап исследования) на поверхности плот-
ной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой
рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невоору-
женным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще пи-
тательной среды. Как правило, каждая колония формируется из по-
томков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточ-
но однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах
являются проявлением их культуральных свойств.
Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изоли-
рованные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обраща-
ют внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности
колоний, их консистенцию и другие признаки. При потребности ис-
следуют колонии под лупой, малым или большим увеличением мик-
роскопа. Структуру колоний исследуют в проходящем свете при ма-
лом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалиновые, зернистые,
нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием
переплетенных нитей в толще колоний.
Характеристика колоний – важная составная часть работы бак-
териолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи
свои особенные колонии.
Колонии характеризуются разными признаками:
1. Величина (диаметр); их разделяют на большие (4−6 мм и
больше), средние (2−4 мм), мелкие (1−2 мм), карликовые или точеч-
ные (меньше 1 мм).
2. Форма колоний. Она может быть самой разнообразной: пра-
вильно круглая, неправильная (амебоподобная), ризоидная.
3. Прозрачность. Колонии бывают прозрачными, пропускаю-
щими свет, и мутными.
4. Рельеф. В вертикальном разрезе колонии разделяются на
плоские, выпуклые, куполообразные, каплеподобные, конусообраз-
ные, плосковыпуклые, плоские (стелятся по поверхности среды),
с вдавленным центром и приподнятою серединой (в виде яичницы-
глазуньи).
5. Поверхность колоний. Может быть матовой или блестящей,
с глянцем, сухой или влажной, гладкой и блестящей или шершавой.
Гладкие и блестящие колонии помечают как S-формы (smooth – глад-
кий и блестящий), а шершавые – R-формы (rough – шершавый,
неравный). Форма шершавых поверхностей также может быть разно-
образной: морщинистой, бородавчатой, иметь радиальную исчер-
ченность и т.п.
6. Цвет. Подавляющее большинство микроорганизмов образуют
бесцветные колонии или мутно-молочного цвета. Однако некоторые
из них формируют цветные колонии. Их цвет определяется пигмен-
том, который синтезируют бактерии: белые, кремовые, желтые, золо-
тистые, синие, красные и т.п.
7. Консистенция. При дотрагивании к колонии петлей можно
определить ее консистенцию: пастообразная, вязкая или слизистая,
сухая, хрупкая и т.п.
Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают их ме-
тодом Грамма для изучения морфологических и тинкториальних
свойств возбудителей, исследуют подвижность бактерий в «висячей»
или «раздавленой» капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое
диагностическое значение при характеристике отдельных видов мик-
роорганизмов.
Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других,
снимают с поверхности среды и засевают на скошенный агар или в
секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой
культуры. Пробирки или чашки с посевами помещают в термостат
при оптимальной температуре на 18−24 года.
Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться
стандартными сухими питательными средами, которые выпускает
микробиологическая промышленность. Такие среды позволяют су-
щественно улучшить результаты микробиологических исследований
и стандартизировать их.
На жидких питательных средах бактерии также могут расти по-
разному, хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на
плотных.
Бактерии способны вызывать диффузное помутнение среды.
Такой характер роста чаще всего наблюдается в большинстве фа-
культативно анаэробных микроорганизмов.
Порой происходит образование осадка на дне пробирки. Он
может быть крошкообразным, гомогенным, вязким, слизистым и др.
Среда над ним может оставаться прозрачной или становиться мут-
ной. Если микробы не образуют пигменты, осадок имеет серовато-
белый или желтоватый цвет. Подобным образом растут, как правило,
анаэробные бактерии.
Пристеночный рост проявляется образованием хлопьев, зерен,
прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. Среда при этом
остается прозрачной.
Аэробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту.
Часто образуется нежная бесцветная или голубоватая пленка в виде
едва заметного налета на поверхности, которая исчезает при стряхи-
вании или взбалтывании среды. Пленка может быть влажной, тол-
стой, иметь вязкую, слизистую консистенцию и прилипать к петле
(тянутся за ней). Однако встречается и плотная, сухая, хрупкая плен-
ка, цвет которой зависит от пигмента, который производится микро-
организмами.
В случае необходимости изготовливается мазок, окрашивается,
исследуется под микроскопом, а микроорганизмы засеваются петлей
на поверхность плотной питательной среды для получения изолиро-
ванных колоний.
На третий день (3-й этап исследования) изучают характер
роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентифи-
кацию.
Сначала обращают внимание на особенности роста микроорга-
низмов на среде и делают мазок, крася его за методом Грама, с целью
проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают
бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (спо-
собность окрашиваться) свойств, делают вывод, что культура чиста.
В некоторых случаях уже за внешним видом и особенностями их ро-
ста можно сделать вывод о виде выделенных возбудителей. Опреде-
ление вида бактерий по их морфологическим признакам называется
морфологической идентификацией. Определение вида возбудителей
по их культуральныи признакам называют культуральной идентифи-
кацией.
Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окон-
чательный вывод о виде выделенных микробов. Поэтому изучают
биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.
Чаще всего исследуют сахаролитические, протеолитические,
пептолитические, гемолитические свойства, образования ферментов
декарбоксилаз, оксидазы, каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы, фиб-
ринолизина, восстановление нитратов в нитриты и т.п. Для этого су-
ществуют специальные питательные среды, которые засевают мик-
роорганизмами (пестрый ряд Гисса, МПБ, свернутая сыворотка,
молоко и др.).
Определение вида возбудителя по его биохимическим свой-
ствам называется биохимической идентификацией.
Для исследования способности бактерий расщеплять белки
(протеолитические _______свойства) используют молоко или среду с жела-
тином. Протеолиз в молоке выражается растворением сгустка казеи-
на, который образован бактериями, свертывающими молоко.
Среды с желатином готовят на мясной воде, добавляя 1 % пеп-
тона, 0,5 % хлорида натрия и 10−20 % желатина. Посев делают уко-
лом. Протеолиз проявляется разжижением столбика среды. Посколь-
ку некоторые виды бактерий отличаются особенностями разжижения
желатина, этот признак можно учитывать при их идентификации.
Пептолитические свойства (способность расщеплять пептоны –
продукты неполного гидролиза белка) обнаруживают с помощью
МПБ и пептонной воды. Их засевают микроорганизмами, а затем
определяют образование конечных продуктов – аммиака, сероводо-
рода и индола. Для нахождения аммиака в пробирку вставляют и
прижимают пробкой красную лакмусовую бумажку. В атмосфере
аммиака он приобретает синий цвет. Индикатором на сероводород
является раствор ацетата свинца, который при аналогичных условиях
определения окрашивает фильтровальную бумагу, смоченную инди-
катором, в черный цвет за счет образования сульфида свинца.
Индол можно обнаружить с помощью полоски фильтровальной
бумаги, смоченной 12 % раствором щавелевой кислоты. При наличии
индола бумага приобретает розовый цвет. Более чувствительным яв-
ляется метод Эрлиха. Согласно общепринятному методу пробкой
пробирки прижимают бумагу, пропитанную специальным индикато-
ром (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида). При
наличии индола цвет его изменяется на сиренево-розовый или мали-
новый. В другом варианте определения индола к 48-часовой бульон-
ной культуре бактерий добавляют 1−2 мл серного эфира, а затем –
реактив Эриха. В нижней части слоя эфира за 1−2 мин появляется
яркое малиновое кольцо.
В микробиологической практике широко используются диффе-
ренциально диагностические среды Ендо, Левина, Плоскирева, кото-
рые позволяют обнаружить разложение лактозы бактериями. Они
позволяют проводить первичную дифференциацию бактерий кишеч-
ного тракта, что чрезвычайно важно для быстрого выделения чистых
культур с их следующей идентификацией. Эти среды селективные
для многих представителей семьи кишечных бактерий. Выпускаются
они в сухом виде, поэтому их приготовление в лабораториях не нуж-
дается в затрате времени.
Среда Эндо состоит из сухого питательного агара, 1 % лактозы
и индикатора фуксина, обесцвеченного раствором сульфита натрия.
Свежая среда имеет слабую розовую окраску. При росте лактозопо-
зитивних микроорганизмов, тех, которые расщепляют лактозу
(E. сoli), их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металли-
ческим блеском. Колонии лактозонегативних микробов (сальмонел-
лы, шигеллы) на этой среде бесцветны.
В состав среды Левина также входят МПА, лактоза, однозаме-
щенный фосфат калия, индикаторы метиленовый синей, эозин. На-
тивная среда имеет фиолетовый цвет. Колонии лактозопозитивных
бактерий имеют темно-синюю расцветку, а лактозонегативные – ро-
зовый оттенок.
Сухой бакто-агар Плоскирева (Бактоагар Же, MacConkey Agar)
содержит в составе агар с солями желчных кислот, лактозу, цитрат
натрия, гипосульфит, фосфат натрия, брилинтовый зеленый, соду
кальцинированная, йод и нейтральный красный. Микроорганизмы,
которые расщепляют лактозу, образуют колонии розового цвета, а те,
что ее не ферментируют, – бесцветные.
В микробиологической практике часто возникает потребность
исследовать ферментацию не только одного, а одновременно не-
скольких углеводов. С этой целью используют среды Гисса. Они мо-
гут иметь жидкую и полужидкую консистенцию.
Основой жидкой среды является 1 % пептонная вода с 0,5 %
натрия хлорид, 1 % углеводов (глюкозы, мальтозы, лактозы, саха-
розы, маннита и др.). К нему добавляют индикатор Андреде (кис-
лый фуксин в 1 н. растворе NаOH). Устанавливают рН 7,2, при ко-
тором среда имеет желтый цвет. Среды с разными углеводами
разливают в отдельные пробирки, в которые устанавливают попла-
вок – __________запаянную из одного конца стеклянную трубочку длиной 3 см
открытым концом книзу. Стерилизуют паром под давлением 0,5 атм
15 мин.
После посева бактерий, если они ферментируют углеводы,
наблюдают появление красной окраски, которая свидетельствует об
изменении рН в кислую сторону (образование кислоты), а порой из
поплавка вытесняется жидкость. Тогда делают вывод об образовании
газа. Следовательно, возможны три варианта при учете результатов
посева на средах Гисса: микроорганизмы не ферментируют субстра-
ту (негативный ответ) или бактерии ферментируют углеводы (пози-
тивный ответ) с образованием кислоты без газа или кислоты и газа.
Учитывая, что микроорганизмы по-разному действуют на угле-
воды (разлагают или не разлагают), при конечном учете результатов
наблюдают пробирки с измененным или неизмененным цветом жид-
кости. Это создает впечатление пестроты, а такой ряд называют пест-
рым рядом Гисса.
В настоящий момент в большинстве случаев пользуются набо-
ром сухих сред для определения сахаролитичних ферментов, из кото-
рых готовят полужидкие пестрые ряды. В отличие от предыдущей
группы в их состав входят индикаторы ВР (смесь водного голубого с
розоловой кислотоы). При наличии газа наблюдаются пузырьки или
разрывы питательной среды в толще агара. При подкислении среды с
индикатором ВР она становится синей, а при подщелачивании –
красной.
Выпускаются также сухие среды Рассела и сахарный агар с мо-
чевиной Олькеницкого.
Среда Рессела является полужидким агаром с лактозой (1 %) и
глюкозой (0,1 %) и индикатором ВР. После разливания его в пробир-
ки их кладут так, чтобы образовался столбик агара и была скошена
поверхность. Микроорганизмы засевают петлей сначала уколом в
столбик, а затем по скошенной поверхности. Если бактерии фермен-
тируют лактозу и глюкозу, наблюдают изменение цвета (подкисле-
ние) всей среды на синий. Если микробы способны метаболизировать
только глюкозу, в этом случае изменяет цвет столбик среды. При
условии образования газа наблюдают за появлением его пузырьков
или разрывами агара.
Трисахарный агар с мочевиной Олькеницкого – более сложная
среда по сравнению с предыдущими. Он позволяет определить фер-
ментацию лактозы, сахарозы, глюкозы, образования сероводорода и
наличие у бактерий фермента уреазы. В состав среды соответственно
вводят сухой питательный агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, ком-
плексную соль аммоний-железо сульфат, тиосульфат натрия, моче-
вину, индикатор феноловый красный. Готовая среда имеет бледно-
розовый цвет.
При расщеплении сахаров феноловый красный окрашивает сре-
ду в желтый цвет. Поскольку глюкоза имеется в небольших концен-
трациях (0,1 %), в аэробных условиях (скошенная поверхность) бак-
терии полностью будут утилизировать ее за первые часы роста. Через
18−24 ч они используют и пептоны как белковую питательную осно-
ву. При этом образуется аммиак, который делает среду щелочной,
окрашивая ее в красный цвет. Однако в столбике агара желтый цвет
остается, потому что там сохраняются кислые конечные продукты,
которые обеспечивают низкий уровень рН.
Энтеробактерии, которые разлагают лактозу и глюкозу, подкис-
ляют среду во всей пробирке (желтый цвет столбика и скошенной
поверхности). Поскольку лактозы (1 %) в 10 раз больше, чем глюко-
зы, через 18−24 ч инкубации ее запасы еще не исчерпаны, поэтому
сохраняется желтый цвет среды. Однако через 48 ч за счет расщепле-
ния пептонов можно наблюдать за его покраснением (сдвиг рН в ще-
лочную сторону).__
Если бактерии образуют газ (углекислый, водород) при фермен-
тации сахаров, появляются разрывы среды или происходит скопление
газа на дне, который поднимает агар в пробирке.
Сероводород микробы образуют из неорганических соедине-
ний, благодаря ферменту тиосульфатредуктазе. Взаимодействуют с
сероводородом соли железа, которые, вступая с ним в реакцию, обра-
зуют сульфид железа в виде нерастворимого преципитата черного
цвета в столбике.
Уреаза, которую продуцируют бактерии, разрушает мочевину с
выделением большого количества аммиака, под воздействием кото-
рого вся среда алеет. Поэтому при наличии уреазопозитивних штам-
мов провести учет ферментации сахаров невозможно. В таких случа-
ях необходимо использовать другие среды.
За последние годы в практике микробиологических лаборато-
рий начали использовать специальные тест-системы для определе-
ния разнообразных свойств бактерий: «Roche», «API», «Enterotest»,
пластины и диски индикаторные биохимические. Они удобны для
пользования, надежные, позволяют определять 12−20 и больше
разнообразных признаков, значительно облегчить идентификацию
микробов.
Гемолитическая активность микроорганизмов является одним
из самых существенных признаков их вирулентности, потому ее
определение стало рутинной процедурой любой специализированной
лаборатории. С этой целью используют кровяной МПА. Его готовят
из растопленного и охлажденного до 45−50 °С питательного агара, к
которому добавляют 5−10 % дефибрированной или свежей крови жи-
вотного (барана или кролика). Агар с кровью тщательным образом
перемешивают, не допуская образования пены, и разливают в чашки
Петри. Если бактерии продуцируют гемолизины, вокруг колоний или
штрихов посева образуются зоны просветления на матовом красном
фоне. По цвету гемолиза (бесцветный, зеленоватый) можно опреде-
лить тип гемолизинов (альфа-, бета-, гамма-, дельта- и т.п.). Чтобы
обнаружить липолитические свойства микробов, в состав питатель-
ных сред вводят липиды или жироподобные субстанции. Бактерии
при таких условиях образуют радужные венчики вокруг колоний при
расщеплении липидов.
Редуцирующие свойства изучают, добавляя в состав сред кра-
сители (метиленовый синий, например), которые способны возобнов-
ляться. Фиксируя время изменения цвета индикатора, можно судить о
степени выражения редуцирующей активности.
Декарбоксилазную активность бактерий оценивают на специ-
альных средах с аминокислотами (лизином, орнитином, глютамино-
вой кислотой и др.) и соответствующими индикаторами.
С целью установления видовой принадлежности бактерий часто
изучают их антигенное строение, т.е. проводят идентификацию по
антигенными свойствами. Каждый микроорганизм имеет в своем со-
ставе разные антигенные субстанции. В частности, представители
семьи энтеробактерий (ешерихии, сальмонели, шигели) содержат
оболочковый О-антиген, жгутиковый Н-антиген и капсульный
К-антиген. Они неоднородны по химическому составу, потому суще-
ствуют во многих вариантах. Их можно определить с помощью спе-
цифических аглютиногенных сывороток. Такое определение вида
бактерий носит название серологической идентификации. Ее относят
к одному из главных методов установления вида выделенной культу-
ры. Чаще всего используется ориентировочная реакция агглютинации
на стекле. С этой целью на предметное стекло наносят разные диа-
гностические сыворотки (против отдельных возбудителей или их ан-
тигенов), а затем в каждую каплю вносят стерильной петлей неболь-
шое количество чистой культуры. За несколько минут наблюдают за
феноменом агглютинации. Образование аглютината (хлопьев) свиде-
тельствует о гомологичности антигенов возбудителя и антител диа-
гностической сыворотки, что позволяет определить вид инфекцион-
ного агента. При наличии позитивной ориентировочной реакции
агглютинации ее ставят в развернутом варианте (реакция агглютина-
ции Грубера).
При некоторых инфекционных заболеваниях (дифтерия) иден-
тификацию _______проводят по токсигенным свойствам микробов. Метод
основывается на определении токсигенной активности коринебакте-
рий дифтерии с помощью реакции преципитации. Образование линий
преципитации между колониями токсигенних штаммов и бумагой,
пропитанной антитоксинной сывороткой, свидетельствует о позитив-
ной реакции.
Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лаборатор-
ных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями,
которые вызывают возбудители в организме (туберкулез, ботулизм,
столбняк, сальмонеллез и т.п.). Такой метод называют идентифика-
цией по биологическим свойствам. Как объекты чаще всего исполь-
зуют гвинейских свинок, белых мышей и крыс.
Очень важным при выделении микроорганизмов является опре-
деление их чувствительности к антибиотикам с целью выбора опти-
мального препарата для лечения. Чаще всего пользуются методом
стандартных дисков (метод диффузии в агар, диско-дифузийний ме-
тод). Для этого на поверхность специальной плотной питательной
среды в чашках Петри засевают культуру микроорганизмов и нала-
гают бумажные диски, пропитанные разными антибиотиками. Посе-
вы инкубируют при оптимальной температуре 18−24 ч и измеряют
зоны задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками. По
размерами этих зон определяют принадлежность бактерий к чувстви-
тельным, умеренно резистентным или стойким штаммам.
На основании изучения морфологических, культуральных, био-
химических, антигенных, биологических и других свойств микробов
делают окончательный вывод об идентификации. Например: «Выде-
лено Escherichia coli» или «Выделенный возбудитель принадлежит к
виду Staphylococcus epidermidis».
Рис. 17. Анаэростат и система «Gas Generating Box»
Дата: 2019-03-05, просмотров: 338.
