Метод определения концентрации антипирина в слюне

Утром натощак обследуемые должны принять 500 мг антипирина внутрь. Забор образцов слюны проводится через 3, 6, 9, 12 и 24 часа после приема антипирина. Объем каждого образца слюны должен составлять не менее 3 мл.

Концентрация антипирина в слюне или крови определяют спектрофотометрическим методом по Brodie et al. [107, 8] с небольшой модификацией (см. ниже).

Мы не поддерживаем предварительное центрифугирование слюны для осаждения крупных частиц взвеси, как это рекомендуют Семенюк А.В.

и соавт. (1982) [107], так как этот этап по нашему мнению не является необходимым. Наличие нерастворимых и не взаимодействующих с используемыми реактивами включений не препятствует определению

антипирина. В случае загрязнения образцов слюны взвесью, которая после

24

осаждения белков цинковым реактивом приводит к окрашиванию супернатанта, предварительное центрифугирование не позволяет решить эту проблему. Большинство лекарственных средств не мешает определению антипирина. Однако мы рекомендуем избегать приема биологически активных добавок и лекарственных трав, поскольку они имеют сложный состав и трудно исключить или подтвердить наличие или отсутствие взаимодействующих с нитритом компонентов. Нельзя проводить антипириновый тест на фоне лечения клозапином и метронидазолом, так как эти лекарственные средства взаимодействуют с нитритом с формированием сине-зеленого окрашивания, препятствующего корректному определению концентрации антипирина.

Осаждение белков и муцинов проводят с использованием цинкового реактива. Мы предлагаем пропорциональное уменьшение объемов слюны

и всех реактивов в 3 раза (с 3 мл до 1 мл), так как в этом случае не происходит изменения показателей экстинции и облегчается сбор материала. К 1 мл слюны добавляют 1 мл дистиллированной воды, 1 мл цинкового реактива (10% раствор сульфата цинка в 1,44 н. растворе серной кислоты), 1 мл 0,75 н гидроксида натрия. Для получения прозрачного супернатанта смесь центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин.

К 2 мл прозрачного супернатанта добавляют 50 мкл 4 н. серной кислоты и 100 мкл 0,2% нитрита натрия. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 20 минут.

Оптическую плотность растворов определяют при длине волны 350 нм на спектрофотометре против контрольной пробы. Контрольная проба содержит 2 мл дистиллированной воды, 50 мкл 4 н. серной кислоты

и 100 мкл 0,2% нитрита натрия. Все реакции проводят в двух параллельных сериях с последующим вычислением средней арифметической.

Калибровочную кривую строят по среднеарифметическим данным, полученным в результате трехкратного анализа образцов слюны,

25

содержащих 2, 4, 8, 12, 16 и 20 мкг/мл антипирина. В указанных пределах сохранялется линейная зависимость концентрация–оптическая плотность.

Концентрацию антипирина определяют по калибровочной кривой в мкг/мл.

Метод определения концентрации антипирина в сыворотке крови

Забор образцов крови проводят до приема 500 мг антипирина натощак (нулевая проба) и через 3, 6, 9, 12 и 24 часа после него. Объем каждого образца, за исключением пробы через 24 ч, составляет не менее 5 мл, через 24 часа после приема антипирина забирают не менее 10 мл крови. Для получения сыворотки образцы центрифугируют при 2000 об/мин 10 минут.

Осаждение белков проводят с использованием цинкового реактива.

К 1 мл сыворотки крови добавляют 1 мл дистиллированной воды, 1 мл цинкового реактива (10% раствор сульфата цинка в 1,44 н. растворе серной кислоты), 1 мл 0,75 н гидроксида натрия. Для получения прозрачного супернатанта смесь центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин.

К 2 мл прозрачного супернатанта добавляют 50 мкл 4 н. серной кислоты и 100 мкл 0,2% нитрита натрия. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 20 минут.

Оптическую плотность растворов определяют при длине волны 350 нм на спектрофотометре против нулевой пробы. Все реакции проводят

в двух параллельных сериях с последующим вычислением средней арифметической.

Калибровочную кривую строят по среднеарифметическим данным, полученным в результате трехкратного анализа образцов сыворотки крови,

26

содержащих 2, 4, 8, 12, 16 и 20 мкг/мл антипирина. В указанных пределах сохраняется линейная зависимость концентрация–оптическая плотность.

Концентрацию антипирина определяют по калибровочной кривой в мкг/мл.