Гибридологический метод. Закономерности
Поможем в ✍️ написании учебной работы
Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

Вопрос №1

Методы.

1.Гибридологический – заключается в гибридизации и последующем учете расщеплений, был предложен Менделем. Правила:

· скрещиваемые организмы должны принадлежать к одному виду.

· Скр.орг. должны четко различаться по отдельным признакам.

· изучаемые признаки должны быть константны, те воспроизводиться из поколения в поколение при скрещивании в пределах линии.

· Необходимы характеристика и количественный учет всех классов расщепления, если оно наблюдается у гибридов первого и последующего поколений.

2.Математический

Мендель применил количественный подход к изучению рез-ов скрещиваний. Сравнение количественных данных эксперимента с теоретически ожидаемыми. Изучение изменчивости наследственной или модификационной.

3.Цитологический

Нужен для изучения клетки как основной единицы живой материи. Исследование строения хромосом, их функций.

4.Физико-химический

Применим для более детального изучения характеристики наследуемых признаков обмена в-в, изучения св-в молекул белков и нуклеиновых кислот + методы иммунологии и иммунохимии. Оптические, седиментационные, методы меченых атомов.

5. Морфометрический

6. Популяционный

7. Генеалогический

Даёт возможность выявить генетические изменения.

Методы:

1. Молекулярный уровень – стр. нуклеиновых к-т. Секвенирование.

2. Субклеточный – цитогенетические методы (микроскопия и окрашивание)

3. Клеточный – онтогенетические методы

4. Организм – мутационный и рекомбинационный анализ, гибридологический, генеалогический, близнецовый методы.

5. Популяция – популяционный анализ, статистические методы.

Вопрос №2

Цитологический метод используется для непосредственного изучения клеточных структур – носителей наследственной информации. Генетическая информация содержится в хромосомах и самовоспроизводящихся клеточных органеллах.

n – число хромосом, с – число молекул ДНК.

Митоз: Клеточный цикл – 4 периода: пресинтетический (G1), период синтеза (S), постсинтетический (G2), и митоз (М). Митоз составляет ок. 1/8 всего клеточного цикла.

Профаза (2 n 4 c ): Спирализация хромосом, каждая сост. из 2 хроматид (результат репликации в S периоде). Исчезают ядрышки и ядерная мембрана.

Прометафаза (2 n 4 c ): Хромосомы двигаются к экватору клетки.

Метафаза (2 n 4 c ): Хромосомы образуют метафазную пластинку, появляются нити ахроматинового веретена. Центриоли находятся на полюсах клетки. Число и форма хромосом, наблюдаемых в метафазе, характеризуют кариотип вида.

Анафаза (4 n 4 c ): Деление цетромер, удерживавших хроматиды в хромосоме. Дочерние хромосомы расходится к противоположным полюсам.

Телофаза и цитокинез (2 n 4 c ): Формируется ядерная мембрана и ядрышки, хромосомы деспирализуются, клетки животных разделяются перетяжкой, у растений образуется фрагмопласт.

Схема: 2n2c – 2n4c – 4n4c - 2n2c.

Мейоз: 2 деления

Профаза 1 (2 n 4 c ):

Лептотена Появление тонких перекрученных нитей хромосом (хромосомы удвоены)

Зиготена Конъюгация хромосом. Появляется синаптонемный комплекс. Досинтез ДНК (0.3%)

Пахитена Гаплоидное число бивалентов. Завершение формирования СК. Досинтез ДНК (0.1%)

Диплотена Начало отталкивания гомологов – различимы хиазмы. Много ядрышек.

Диакинез Спирализация усиливается, число хиазм уменьшается, биваленты на периферии ядра.

Метафаза 1 (2 n 4 c ): Разрушение ядерной мембраны. Ядрышки исчезают. Биваленты выстраиваются в метафазную пластинку.

Анафаза 1 (2 n 4 c ): К разным полюсам расходятся гомологичные хромосомы, состоящие из 2 хроматид. Редукция центоромер.

Телофаза 1(1 n 2 c ): может отсутствовать, или ядро может восстанавливаться

Интерфаза Короткая, нет удвоения хромосом.

Профаза 2, Метафаза 2 (1n2c): по митотическому типу.

Анафаза 2 (2 n 2 c ): Расхождение хроматид.

Телофаза 2 ( nc ): 4 гаплоидных ядра.

Схема: 2n4c – 2n4c – 1n2c – 1n1c.

 

Вопрос №3

Вопрос №4

Закон чистоты гамет

Аллели не исчезают никуда, не берутся ниоткуда, передаются в неизменном виде. В каждую гамету попадает только один аллель из пары аллелей данного гена родительской особи. Если у особи присутствует и доминантная, и рецессивная аллель, то доминантная маскирует рецессивную. Связь между поколениями при половом размножении осуществляется через половые клетки — гаметы. Следовательно, необходимо допустить, что каждая гамета несет только один фактор из пары. Появление во втором поколении рецессивного признака одного из родителей может быть только при двух условиях:

1) если у гибридов наследственные факторы сохраняются в неизменном виде;

2) если половые клетки содержат только один наследственный фактор из аллельной пары.

Расщепление потомства при скрещивании гетерозиготных особей Мендель объяснил тем, что гаметы генетически чисты, то есть несут только один ген из аллельной пары. Мендель не связывал наследств. факторы с конкретн. матер. структурами, цитологическое обоснование появилось позже: Во время мейоза у гибрида F1(Аа) разные пары хромосом расходятся в дочерн.клетки независимо =>при случ. оплодотворении – 3 типа зигот (АА, Аа и аа).

Другое док-во – тетрадный анализ: проводится на орг-х, у которых все 4 продукта мейоза остаются вместе и могут далее функц. как вегетет. клетки (аскомицеты). У аскомицетов в рез-те мейоза дипл. вегет. клетки образ. аски, содерж. по 4 гапл. аскоспоры. Аскоспоры можно извлечь и получить вегет. клон - культуру каждой из них. Если исходный диплоид был гетерозиготен по к-л. гену,напр. ADE2/ade2, то в каждой тетраде две споры обычно образ. белые колонии(ADE2), а две другие - красные (ade2).Это расщепление - общая закономерность, характерная для моногенного наследования. Т.о., тетрадный анализ доказывает, что в основе менделевских соотношений лежит строгий биол. закон гаметического расщепления 2A:2a в каждом мейозе.

Вопрос №5

Вопрос №6

Вопрос №7

Вопрос №8

Анализ дигибридного скрещивания. Закон независимого наследования признаков. Суть и цитологические основы.

 

Дигибриды – гибриды, полученные от скрещивания организмов, отличающихся одновременно двумя парами альтернативных признаков.

Для первого скрещивания исп-сь гомозиготы, отличающиеся по двум парам признаков (форма и окраска семян). Генотип материнской особи ААВВ, отцовской – ааbb. В F1 – единообразие фенотипов – все дигетерозиготы (для проверки гетерозиготности этих растений примен-ся анализирующее скрещивание - с дигомозиготой). Растения в F1 с равной вероятностью дают гаметы AB, Ab, aB и ab =>16 равновероятных генотипов =>расщепление 9:3:3:1 по фенотипу (имело место полное доминирование). Можно определить по решетке Пеннета или математически. Произведение отдельных вероятностей дает отношение классов расщепления по фенотипу 9/16:3/16:3/16:1/16. По генотипу будет 9 классов расщепления. Вероятность появления генотипа АА= ¼ , Аа= ½ , для аа= ¼ . Для гена В тоже самое. Т.о. в случае 2-х генов число классов соответствует по фенотипу 22 , по генотипу – 32. Для статистической оценки отклонения применяют метод c2. c2=åd2/q

Вывод: Признаки наследовались независимо. Цитолог.основа – случайность ориентации хромосом в метафазе II мейоза =>случайное сочетание негомологичных хромосом у полюсов клетки =>равная вероятность обр-ия АВ-, Ав-, аВ- и ав-гамет. При оплодотворении соединение этих гамет должно происходить также по правилам случайных сочетаний, но с равной вероятностью для каждого. В F2 возникают 16 типов зигот.

Пропорции, наблюдавшиеся Менделем соблюд-ся при условии: гомозиготности исх.форм, альт.проявлениях признаков, одинаковой жизнеспособности гамет с разными генотипами, независимости проявления признака от внешн.условиях и генотип.окружения.

Закон независимого наследования: при скрещивании двух особей, отличающихся друг от друга по двум (и более) парам альтернативных признаков, гены и соответствующие им признаки наследуются независимо друг от друга и комбинируются во всех возможных сочетаниях (как и при моногибридном скрещивании). Условие – гены в негомологичных хромосомах.

 

Вопрос №9

Вопрос №10

Вопрос №11

Вопрос №12

Вопрос №13

Вопрос №14 

Вопрос №15

Генетические типы определения пола

Пол – сов-ть детерминант и стр. для обр. гамет, оплод. и раз. эмбриона. Сложный комплексный признак, опред. с-ть морф. и физиол. особенностей орг.

Прогамное (размер яйцеклетки – у тлей), сингамное (серия аллелей 1 ил неск. аутосомных генов, половые, плоидность), эпигамное (внешние условия).

У человека, мухи, большинства позвов, многих насекомых и двудомных у самок ХХ, у самцов ХY.

У Dr mel фенотип по полу определяется соотношением между числом Х-хромосом и аутосом (А).

Число Х-хр Ч-о наборов А        Х/А   Фенотипич. пол

3                       2               1,5       Метасамка*

2                       2               1        Норм. самка

2                       3             0,67    Интерсекс

1                       2             0,5       Норм. самец

1                       3             0,33    Метасамец*

* - очень ослаблены и часто не доживают до стадии половозрелости (супер-)

Механизм не вполне понятен. Конкретные гены: мутантный tra (трансформатор) в гомозиготном состоянии придает особям с двумя Х-хромосомами фенотипический облик самцов (которые стерильны).

Развитие пола у млекопитающих – в 2 этапа: Хромосомный состав ядра => половую дифференциацию гонад в семенники/яичники. Семенники =>тестостерон => мужик. Яичники => нет тестостерона => баба.

Образование семенников <= гены в У-хромосоме. Нерасхождение хромосом => зиготы ХО/2А женского типа, яичники недоразвиты, зиготы ХХУ/2А мужского типа, сперматогенез отсутствует. У человека описаны случаи появления кариотипа ХХХХУ, развитие идет полностью по мужскому типу. У млекопитающих пол определяет У-хромосома.

У птиц и бабочек самцы - гомогаметны, а самки – гетерогаметны (типа ХУ или ХО). Половые хр-мы - Z и W, , при этом самцы - ZZ, а самки – ZW или ZO.

Гаплодиплоидия у пчел и муравьев. Нет половых хромосом: самки – диплоидные, а самцы – гаплоидные. Самки из оплодотворенных яиц, из неоплодотворенных - трутни. У трутней нет отцов. В процессе сперматогенеза не происходит редукции числа хромосом. Матка или рабочая зависит от выкармливания. Большинство растений и некоторые животные гермафродитны, т.е. в одной особи сочетаются свойства обоих полов. Большинство размножаются самооплодотворением.

Дозовая компенсация генов:

· Случ. инактивация Х у самки (млеки)

· Суперэкспрессия Х у самца (мухи)

· У нематод у герм. особей избирательное снижение транскрипции обеих X.

Признаки половых хр-м:

· Гетероморфность

· Компенсация дозы генов Х-хрсм

· Наличие псевдоаутосомных районов

· Пол-детерминирующие аллели

· Район запрета рекомбинации

Эволюция пол. хр-м: SDA => супрессия рекомбинации (ретротранспозоны) => инверсии => гетероморфизм

Обособление Y: пара аутосом => приобретение SDA => накопление ретроэлементов и мутаций => хромосомные перестройки => появление NRY=> расширение его границ =>утрата части генов

 

Вопрос №16

Вопрос №17

Вопрос №18

Вопрос №19

Вопрос №20.                                                                                                         

Вопрос №21

Вопрос №22

Билет №23

Билет №24-25

Вопрос №26

Вопрос №27

Вопрос №28

Вопрос №29

Вопрос №30

Вопрос №31

Вопрос №32

Вопрос №33.

Вопрос №34

Репликационная вилка. Понятие о репликоне. Особенности организации и репликации хромосом про- и эукариот. Структура ориджина репликации у E.coli. Инициация репликации и расплетание двойной спирали ДНК.

Репликационная вилка – точка, в которой нити родительского дуплекса разделены, что даёт возможность репликации. Репликон – единица ДНК, в кот. осуществляется индив акт репликации. Ориджин репликации – точка начала репликации, цис-действующий элемент. У бакт хр-мы один ориджин, единый репликон. Двунаправленная репликация. В эукариотической много ориджинов и репликонов, тоже двунаправленная. У человека 1 ориджин на 90 тпн. Скорость репликации у E.coli – 1000 пн/с, у человека 25 пн/с.

Точка начала репликации у E.coli – oriC – ок 300 пн – AT-богатый участок, DnaА-боксы, сайты метилирования GATC.

Иниц белок DnaА связ с oriC, раскрывает двойную спираль. Участвуют Fis, HU и HIF. При участии DnaC связывается хеликаза DnaB, движется, разделяет цепь, двигает вилку. SSB к однонитевым уч-м. Полностью их покрывает, способствует хеликазе, защита от деградации, предотвращает восстановление дуплекса. Топизомераза (GyrA/GyrB) расплетает ДНК перед вилкой. Т II создаёт разрывы в обеих цепях, TI только в одной.

 

Вопрос №35

Основные принципы репликации: матричный процесс, комплементарный, полуконсервативный, однонаправленный (направления роста и полярности цепей ДНК), полунепрерывный - отстающая и лидирующая цепи, необходимость в праймерах.

5’-фосфат, 3’-гидроксильный. Комплементарные пары оснований.Ген ин-фа из п-ти ДНК прямо передаётся от одного поколения к следующему за счёт с-ти каждой нити ДНК служить матрицей, на кото собирается комплементарная ей нить. Не консервативно, не дисперсно, а полуконсервативно. Можно посмотреть с помощью 15N. Сначала рост на культуре с 15N, потом переносим на среду с 14N. Рост цепи в направлении 5’à3’. Синтез ДНК должен быть иниц праймером. Синтезируется ДНК-праймазой DnaG – РНК-полимеразой. ДНК-поли III осущ репликативный синтез. Отстающая цепь синт в виде Оказаки. DnaG c DnaB, DnaT, PriA-C и матричной ДНК образует праймосому. Синтез фрагмента терминируется перед праймером предыдущего фрагмента, тк у ДНК-поли III нет 5’-3’ экзонуклеазной активности. Начинает работать ДНК-поли I. РНК-праймер удаляется, достройка. Сшивка лигазой. Отстающая нить образует петлю, реплисома осущ синтез обоих нитей, двигается в напр вилки.

ДНК-поли III – DnaE, N, Q, X, holA-E

Послеисинтеза ДНК метилируется – метилаза Dam.

 

Вопрос №36

Вопрос №37

Вопрос №38

Эктопическая рекомбинация как частный случай гомологичной рекомбинации и её биологическое значение. Образование делеций и дупликаций в результате эктопической рекомбинации.

 

Эктопическая – част случай гом рек. М/у идент/сходными посл в геноме, приводит к хр перестройкам. П-ти:

· Подвижные элементы

· Гены тРНК и рРНК

· Гены гистонов и др

При внутримол рек может образоваться делеция, если у нас есть два прямых повтора. При обр синапса дуплекс должен обр петлю. Линейный участок с делецией: п-ть м/у повторами и 1 копия повтора. Делеционный участок замыкается в кольцо.

При межмол рекомбинации рек осущ м/у прямыми п-ми в разных уч-ах гом хр-м. В рез кросса дуплекс с доп копией повтора и распол м/у повторами п-тью. И второй дуплекс, потерявший кусок.

Экт рек: перестройки хр-м, 1 из источников дупл, регул экспрессии путём онтоген перестройки ген матер.

Вопрос №39

Вопрос №40  

Вопрос №41

Вопрос №42.

Вопрос №43

Вопрос №44.                                                                                                                                                       

Вопрос №45

Вопрос №46.

Подвижные элементы эукариот: структурная организация LTR-ретротранспозонов на примере ретротранспозона Ty1 дрожжей.

LTR – с длинными концевыми повторами. Как ретровирус, но без белка вирусной оболочки.

Ty1 – прим 5900 нкт. LTR-какая-то херня (дуплиц повтор?)-gag-pol-LTR

LTR – прямые концевые повторы (330 пн). Дупл повтор ДНК-мишени – 5 пн Примерно 30 копий в геноме дрожжей, 10:-4 за генерацию. У человека свыше 100 тыс копий LTR, у высших растений ок 1млн.

Gag – капсид-подобный белок. Pol: prot, int (интеграза), RT (обр. транскриптаза). Обратная транскрипция в цитоплазме.

 

Вопрос №47.

Вопрос №48.

Вопрос №49.

Вопрос №50

Свойства ген кода

Ген. Код – способ кодировать амк п-ти белков при помощи п-ти нкт.

Триплетность — значащей единицей кода является сочетание трёх нуклеотидов (триплет, или кодон).

Непрерывность — между триплетами нет знаков препинания, то есть информация считывается непрерывно.

Неперекрываемость — один и тот же нуклеотид не может входить одновременно в состав двух или более триплетов.

Однозначность (специфичность) — определённый кодон соответствует только одной аминокислоте.

Вырожденность (избыточность) — одной и той же аминокислоте может соответствовать несколько кодонов.

Универсальность — генетический код работает одинаково в организмах разного уровня сложности — от вирусов до человека.

Вопрос №51

Точковые мутации на молекулярном уровне: молчащие мутации, миссенс-мутации нейтральные (неконсервативные) и радикальные (неконсервативные), нонсенс-мутации, мутации со сдвигом рамки считывания (fram e shift).

Замена пары нкт, делеция, вставка.

Транзиция – пуриновые на пуриновые. АТàGC Трансверсия – пуриновые на пиримидиновые. ATàTA

Консервативные - мутации замен нуклеотидов, не приводящие к смене класса кодируемой аминокислоты. Радикальные - мутации замен нуклеотидов, приводящие к смене класса кодируемой аминокислоты.

Молчащая мутация – UCA=UCC=серин Не проявляется в фенотипе.

Миссенс мутация – серин (UCA) àтреонин (ACA). Треонин экв серину – консервативная мутация. Не проявляется в фенотипе.

                                                    àлейцин (UUA). Белок неактивен – радикальная мутация.

Нонсенс мутация UCAàUAA – выключение белка. Преждевременная терминация трансляции.

Сдвиг рамки – в рез вставки/выпадения нкт, не кратных 3.

 

Вопрос №52.

Вопрос №53.

Вопрос №54.

Механизмы спонтанного мутагенеза: химическая модификация оснований ДНК (образование транзиций в результате дезаминирования оснований). Почему сайты, содержащие метилцитозин характеризуются повышенной мутабильностью.

Дезаминирование – гидролиз экзоцикл аминогрупп Ц, А, Г. Аденин ­­àГипоксантин: АТàГЦ, тк гипоксантин спаривается с цитозином. ЦитозинàУрацил:ГЦàАТ ГуанинàКсантин:ГЦГЦ

Дезаминирование цитозина: 1000 осн на клетку в сутки.

Метилцитозин àТимин: GCàAT

Сайты с метилцитозином – горячие точки мутабильности, тк тимин – в норме в ДНК, ДНК не замечает. Что что-то не так.

Вопрос №55

Механизмы спонтанного мутагенеза: утрата оснований ДНК (образование апиримидиновых и апуриновых сайтов в результате гидролиза гликозидной связи между основанием и дезоксирибозой), окислительные нарушения ДНК.

Образование апуриновых и апиримидиновых сайтов в ре-те гидролиза гликозидной связи м/у основанием и дезокирибозой. За 1 20часовую генерацию ок 10тыс пуриновых и 500 пиримид.

Окислительные повреждения: Г-8оксиГ. ГО компл А. ГС àГОАàТА. От неск сотен до неск тысяч за сутки.

 

Вопрос №56.

Вопрос №57.

Вопрос №58.

Вопрос №59.

Вопрос №60.

Вопрос№ 61.

Понятие о мутагенных индуцибельных путях репарации. SOS-репарация у E.coli и её генетический контроль. SOS-репарация и УФ-индуцированный мутагенез (почему в штаммах E.coli, дефектных по генам recA, umuC, umuD или dinB, УФ-индуцированный мутагенез отсутствует?).

Повреждённое основание ДНК – невозможность специф спаривания оснований. Репликация блокируется. Блок обходится встраиванием неспециф оснований. RecA связ с однонитевой ДНК, образует ДНК-белковые фил-ты – акт форма RecA*, кот запускают индукцию SOS-регулона (более 40 генов). Гены umuC, umuD, dinB – продукты необходимы для репликации в обход повреждений. Частота мутаций повышается.

ДНКполи3 –(SOS-индукция)- ДНКполи5 (umuC, 2umuD’,RecA,АТФ), ДНКполи4 (DinB)

ДНКполи5 – неточная, ошибки каждые 10^-2—10^-3

В штамма, дефектных по этим генам, УФ-индуц мутагенез отсутствует.

 

Вопрос №62

Вопрос №63.

Особенности микроорганизмов как объекта генетических исследований. Основные термины: штамм, дикий тип, клон, клонирование как метод генетического анализа в культуре микроорганизмов. Признаки микробных культур, прототрофы, ауксотрофы. Методы, применяемые в генетическом анализе у бактерий и бактериофагов: клональный анализ, метод селективных сред, метод отпечатков и др.

 

Штамм – ген однородная культура данного вида, выделенная из 1 клетки и отлич от остальных культур происхождением и часто рядом признаков, несущ для систематики.

Дикий тип – штамм, выделенный из природы, типичный представитель данного вида.

Клон – группа клеток или молекул, идент клетке/молекуле, от которой они произошли. В генетике – генет однородное потомство, полученное при размножеии 1 клетки/вирусной частицы. У эукариот клон – потомство 1 клетки, делящейся митотически.

Клонирование: суспензия бактерий à по поверхности агара àкаждая колония от одной клеткиàбакт клоны

Признаки микробных культуур: морфологические, физиол, биохим.

Прототроф – культуры, растущие на минимальной среде. Мин среда – набор в-в, необходимый и дост для роста организма. Ауксотроф – культуры, требующие добавки к мин среде.

Особенности микроорганизмов:

· Простая орг генома

· Гаплоидность (как правило)!!!

· Высокая скорость размножения

· Много потомков от «скрещивания»!!!

· Простые биохим признаки, сост фенотип

· Использование методов селективных сред!!!

· Однородность клеточного состава

Для выделения мутантных клонов, не способных синтезировать необходимые для своего роста вещества и в силу этого неспособных к росту на минимальной среде, анализируемую смесь клеток высевают на полную среду, и от каждой выросшей на ней колонии делают отсевы на две питательные среды: полную и минимальную. В этом случае из клеток с генотипом дикого типа, т. е. не нуждающихся для своего роста в веществах полной среды, разовьются колонии на минимальной среде. Из мутантных клеток, которые утратили свойство синтезировать какое-либо из необходимых для своего роста веществ, на минимальной среде колонии не разовьются. Таким образом, одновременная проверка клонов на двух разных средах позволяет выявить биохимические мутации.

Для облегчения пересева колоний, применяют специальную печатку, имеющую размер чашки Петри. Плоскость печатки покрывают бархатом. Сначала к печатке с бархатом прикладывают чашку с анализируемыми колониями, выросшими на полной среде. На ворсинках бархата остаются клетки отдельных колоний. Затем к этой печатке прикладывают две чашки — с минимальной и полной средой. После инкубации таких отпечатков сопоставляют колонии, выросшие на полной и на минимальной среде. Практически это делают таким образом: чашку с минимальной средой ставят на чашку с полной средой так, чтобы идентичные колонии совпали. Просматривая две совмещенные чашки в проходящем свете, на чашке с полной средой отмечают колонии, которые не выросли на минимальной среде. Это дает возможность обнаружить мутантные колонии.

 

Вопрос №64

Генетические элементы бактериальной клетки: хромосома, плазмиды, профаги, мигрирующие элементы. Организация генетического аппарата у бактерий (топология бактериальных геномов). Общее представление о плазмидах и их разнообразии. Строгий и ослабленный контроль репликации. Плазмиды конъюгативные и неконъюгативные. Мобилизация неконъюгативных плазмид. Плазмиды с узким и широким кругом хозяев.

Плазмиды – кольц мол ДНК. Способны к автономной репликации, имеют собственный ориджин репликации. Профаг – состояние фаговой ДНК при лизогении, при кот фаговая ДНК интегр в бакт хр-му или репл как плазмида. Трансп эл-ты – не сущ автономно, интегр в другие мол ДНК. У киш пал 1 кольц хр-ма, 4289 генов, 4,6х10^6 нкт. У родобактера 2 разл кольц хр, у циано 4-218 идент и 3-8 кольц плазмид, бациллус цереус – 1 кольц хр-ма, 1 мегаплазмида, эпулописциум фишелсони – 85тыс идент хр-м, родококкус фацианс – 1 лин хр-ма, 1 лин плазмида.

ColE1 - бактериоцин, кот убивает E.coli. Источник - E.coli

Tol - деградация толуола и бензойной кислоты. Источник - pseudomonas putida

Ti - индукция опухолей у растений. Источник - agrobacterium tumefaciens

pSum - образование клубеньков на корнях бобовых. Источник - rhizobium meliloti

SCP1 - синтез антибиотика метиленомицина. Источник - streptomyces coelicolor

RK2 - устойчивость к ампицилину, канамицину и тетрациклину. Источник - klebsiella aerogenes

ColE1: неконъюгативнвная, способна к моб, узкий круг хозяев ( сем энтеробактериация), мультикопийная (до 20 копий на кл) 6646 пн

RK2: конъюгативная, широкий круг хозяев, низкая копийность. 60 тыс пн

RSF1010: устойчивость клеток к сульфаниламиду и стрептомицину. Неконъюгативная, способна к моб, широкий круг хозяев, мультикоп (до 30)

Плазмиды со строгим контролем репликации удваиваются синхронно с бактериальной хромосомой и за счет использования одних и тех же репликативных комплексов, в которых главную роль играет ДНК-полимераза III. Таких плазмид в бактериальной клетке может насчитываться от одной до трех копий в расчете на одну копию бактериальной хромосомы молек.масса которых превышает 20 МД. Репликация плазмид с ослабленным контролем происходит с участием ДНК-полимеразы I. В каждой бактериальной клетке содержится в среднем 40–50 копий таких плазмид. В связи с этим плазмиды с ослабленн. контролем репл-ции еще наз. мультикопийными. Молек.м. не более 15–20 МД.

Неконъюгативные плазмиды не содержат tra-генов,и поэтому они неспособны самостоятельно передаваться от одних клеток к другим. Неконъюгативные плазмиды – это мелкие плазмиды с молекулярной массой менее 25 МД. Однако неконъюгативные плазмиды могут быть перенесены в реципиентные клетки с помощью конъюгативных плазмид. Перенос неконъюгативных плазмид с помощью конъюгативных называется мобилизацией. При этом неконъюгативная плазмида является мобилизуемой, а конъюгативная – мобилизующей. Мобилизация может осуществляться из-за наличия в плазмидах IS-элементов и транспозонов, которые обеспечивают объединение двух плазмид друг с другом, т. е. образование коинтегратов.

 

Вопрос №65.

Процессы передачи генетической информации у бактерий: конъюгация. Структура F-фактора. Перенос конъюгативных плазмид на примере F-фактора у E.coli. Схема интеграции F-фактора в хромосому. Образование F’(прим)-факторов, сексдукция, меродиплоиды. Роль конъюгации в горизонтальном переносе генов у бактерий.

Конъюгация – процесс переноса плазмиды, иногда хром ДНК донора, из донора в реципиент при непосредственном контакте или через мостик-подобное соединение. Способность бакт быть донорами определ наличием у них коньюгативных плазмид. При конъюгации могут передаваться участки ДНК длиной сотни-млн пар оснований. F-фактор – 1 описанная плазмида. 100 тыс пн. Ок 60 генов, tra-район – 36 генов. Есть 2 IS3, IS2, Tn1000. Донор – F+, 1-3 пилей. В пилях осевой канал. Обесп контакт, потом сокр àтесный контакт. В сайт oriT плазмиды F вносится 1нит разрыв, с 5 конца в реципиент. В доноре синтезируется компл нить. В рец тоже синтезируется комплементарная нить, замыкается в кольцо.

Достройка в проц протягивания.  И у нас 2 мужика. Перенос хр ДНК не происходит, высокая частота ~ 0.1 F может интегрировать в разл участки в хр-му.

Мерозигота – частичная зигота, тк при переносе хр генов клетка-донор переносит только часть своих генома. Сексдукция – перенос хром генов, обусловленный F’-фактором. Образуются при слишком большом кроссе при исключении F. Могут исп для создания частично дипл штаммов, сод 2 копии опред участка хр-мы.

Лёгкий обмен ген инфой может давать опред преимущества клеткам. Трансконъюганты – клетки, кот получили доп инфу в рез-те конъюгации. Устойчивость к антибиотикам, метабол гены.

 

Вопрос №66.

Процессы передачи генетической информации у бактерий: конъюгация. Образование и свойства Hfr-штаммов. Схема переноса хромосомных генов при конъюгации. Рекомбинация после Hfr-конъюгации.

В популяции F+ клеток плазмида инт в хр-му с низкой частотой => F+ штаммы могут с низкой частотой переносить хром маркеры в F- клетки. Если изолировать кл с инт F-плазмидой и получить чистую культуру, то такие штаммы (Hfr) передают маркеры с высокой частотой ~ 0.01

Hfr – плазмида интегрирована в хромосому. Hfr клетки имеют пили. Тесный контакт, разрыв в oriT плазмиды, в реципиент с 5-конца. В доноре синт комплементарная нить, в рец тоже, но в кольцо не замыкается. Возникает мерозигота. Рекомбинанты в рез-те 2 кросса. Реципиенты не приобретают новых способностей. Вся хромосома переносится редко из-за прерывания скрещивания. Полная копия F-фактора последней, если вообще переносится. Макс 1.5 тыс пар осн, 30 мин.  Рец получает лин фрагмент 2цеп ДНК – замещение гом уч-ка. Одиночный кросс – лин хр-ма – гибель клетки.

 

Вопрос №67.

Вопрос №68

Фаги вирулентные и умеренные, размножение фагов, литический и лизогенный циклы. Профаг, лизогенные клетки. Лизогенная (фаговая) конверсия – пример горизонтального переноса генов.

Фаг: головка, ДНК, хвостовой стержень с футляром, нити отростка, базальная пластинка,.

Т4: 0.065х0.1 мкм. 1 лин 2нит ДНК. 170 тпн. Ок 100 генов.

Литический цикл: Адсорбция àПроникновение фага в кл à Синтез фаговых белков и ДНК àСборка àЛизис клетки

Умеренные спос интегр в геном бакт клетки, переходить в профага.

Лизогенный цикл: Проникновение фага в клетку à интеграция фаговой ДНК с хромосомой бактерии à Спонтанный или индуцированный выход профага из хромосомы àсинтез...

Лизогенные клетки обладают иммунитетом к заражению данным фагом. Иммунитетный репрессор – продукт фагового гена, подавлявляет экспрессию ранних генов фага.

Профаг – неинфекционная форма фага. Лизогенные – клетки, содержащие профаг. Лизогенность – свойство популяции продуцировать с опред частотой зрелые фаговые частицы. Лизогенная конверсия – тип изм бактерий.

Холерный вибрион – холерный токсин, палочка – токсин Шика. Экзооксины код фагами. Бактерии без токсина не патогенны.

 

Вопрос №69

Процессы передачи генетической информации у бактерий: механизмы общей (на примере фага Р1 у E.coli) и специфической трансдукции, опосредованной фагом λ.

Трансдукция – перенос ДНК в клетку-реципиент из клетки-донора, осуществляемый бактериофагом.

При форм фаговых част у 0.3% популяции фага в головку включается фрагмент хромосомной ДНК. В головку ок 1,5% генома бактерии (~65 генов, ок 96000 пн) Рекомбинанты в рез-те двойного кросса.

Спец трансдукция: перенос определённых генов. Лямбда – gal и bio. Частота 10^-5 – 10^-6. Сайт-специф рекомб при участии int и xis. ДНК фага 49 тпн. При ошибки вырезания в фаг может попасть ближайший ген. В капсиду 78-105% генома фага: 38-52 тпн. Транс фаг дефектен, способен только инфиц. Att-сайт гибриден, не может интегрировать. Нужен фаг-помощник. Участки хром ДНК могут рекомб с хромосомной ДНК реципиента. Не обр лизогенных трансдуктантов. Если есть оба фага, то происх двойная лизогенизация обоими фагами. Образуются частичные гетерозиготы (гетерогеноты).

Было gal- -- attB – bio. Стало: gal- -- attL – gal+ -- attL – фаг-помошник – attR – bio

Трансдуктанты не стабильны, выщепляют клетки gal-  с частотой 2х10^-3 на деление.

 

Вопрос №70

Вопрос №71

Уровни регуляции экспрессии генов: особенности у про- и эукариотических организмов. Многообразие механизмов посттрансляционной регуляции генного действия: роль пептидаз, шаперонов и ковалентной модификации белков у про- и эукариотических организмов.

Уровни: изм стр хроматина, транскрипционный, постранскрипц.: процессинг, стабильность РНК и трансляционный, пострансляционный процессинг и модиф белков.

Базовое сост про гена – включён, у эу – выключен. У про РНК-поли связ с промотором, если нет репрессора, активаторы увел связывание. У эу надо менять стр хроматина. Изм зависят от модиф гист белков, от связ со спец последовательностями ДНК-связ рег белков.

Если будет мутация в генах, код пептидазы, шапероны, ферменты, отв за модификацию, то даже при отсутствии мутаций в генах белка, он не будет работать. Стабильность полипептидов в клетках зависит от протеаз, играющих важную регуляторную роль. Они осуществляют процессинг при их секреции и транспорте через мембраны, превращают пре-белки в белки, отщепляют N-концевой формилметионин и т.д.

Они гидролизуют нефункциональные, денатурированные, испорченные в процессе работы белки и мультиферментные комплексы. Специальные белки-шапероны обеспечивают правильную третичную

структуру белков. Специальные ферментные системы осуществляют ковалентную модификацию белков, добавляя или удаляя химические группы. Эти изменения в структуре и функции белков являются чувствительным методом клеточной регуляции. Реакции ковалентной модификации включают фосфорилирование, ацетилирование, метилирование, аденилирование, рибозилирование и т.д. В большинстве случаев ковалентная модификация является обратимой.

 Инициация транскрипции у эукариот нуждается в ремоделировании хроматина. Перед транскрипцией структура хроматина должна быть изменена в более открытую конформацию, чтобы ДНК стала более доступной для транскрипционного аппарата.

Транскрипция у эукариот осуществляется в ядре при участии трех различных форм РНК-полимеразы. Транскрипция и трансляция у эукариот не сопряжены как у прокариот, а разделены в пространстве и времени. Для трансляции мРНК должна экспортироваться в цитоплазму. укариотическая РНК-полимераза не может самостоятельно инициировать транскрипцию. Для ее активации необходимо большое количество белков (факторов транскрипции), которые объединяются в комплекс. В инициации и регуляции транскрипции у эукариот участвует гораздо больше типов регуляторных белков (транс-действующих факторов) и типов взаимодействия с регуляторными (цис-действующими) последовательностями ДНК

(активаторные последовательности, энхансеры, глушители). Оперонная организация генов и, следовательно, полигенная РНК у эукариот – редкое явление. Пре-мРНК у эукариот подвергается существенной модификации (процессингу) в ядре перед трансляцией. Многие гены эукариот имеют прерывистую структуру и содержат участки некодирующей ДНК (интроны), которые транскрибируются и затем удаляются с помощью сплайсинга. Эукариоты являются многоклеточными, и экспрессия генов может зависеть от стадии развития организма и быть тканеспецифической

 

Вопрос №72.

Билет №73

Вопрос №74

Вопрос №75

Оперонные системы регуляции на примере лактозного оперона E.coli.

 

Оперон – группа тесно сцепленных генов, транскрибируемых в единую мРНК. Транскрипция оперона контролируется общими регуляторными элементами (промотор, оператор). У E.coli около 600 оперонов.

β-галактозидаза (продукт гена lacZ) катализирует гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу. Клетки E.coli содержат β-галактозидазу только в том случае, если растут на среде, содержащей лактозу в качестве единственного источника углерода и энергии. На среде, содержащей глюкозу, синтез β-галактозидазы в клетках отсутствует. Лактоза является индуктором синтеза β-галактозидазы.

Лактозный оперон состоит из трех структурных генов – lacZ, lacY (пермеаза) и lacA (трансацетилаза), продукты которых необходимы для использования лактозы в качестве источника углерода, промотора, с которым связывается РНК-полимераза, и операторного участка (оператора), с которым связывается белок-репрессор – продукт гена lacI. Оперон имеет один промотор и перекрывающийся с ним оператор, а также один основной терминатор транскрипции, поэтому все входящие в оперон гены транскрибируются в одну

полигенную мРНК.

 

Вопрос №76.

Принципы негативного и позитивного контроля на примере лактозного оперона E.coli.

 

Ген-регулятор лактозного оперона (lacI) кодирует белок-репрессор. В активной форме этот белок-репрессор связывается с оператором. Оператор – это участок ДНК, с которым связывается белок-репрессор. Сам ген lacI в состав оперона не входит, поскольку экспрессия его осуществляется с собственного промотора. Это конститутивный ген, т.е. нерегулируемый.

Ген lacI экспрессируется конститутивно, поэтому в отсутствии индуктора (лактозы) транскрипция оперона

репрессируется (негативная регуляция). Lac-репрессор имеет два различных сайта связывания - аллостерический белок.

Катаболитная репрессия или глюкозного эффекта - неспособность клеток E.coli катаболизировать

различные углеводы в присутствии глюкозы, как более эффективного источника энергии.

Мутации в двух локусах, локализованных за пределами lac-оперона приводят к 50-ти кратному уменьшению синтеза β-галактозидазы. Ген cya кодирует аденилатциклазу, конвертирующую АТФ в цАМФ. Ген cap кодирует белок CAP – catabolite activator protein (БАК – белок активатор катаболизма). Белок БАК образует

комплекс с цАМФ, активируется и связывается с БАК-сайтом, расположенным в промоторе. Увеличение

аффинности РНК-полимеразы к промотору и усилению транскрипции. Глюкоза вызывает катаболитную

репрессию, снижая уровень циклического АМФ. цАМФ – сигнал энергетического голода. Это позитивная регуляция.

Г+ Л+: базальный уровень экспрессии, ничего не сидит.

Г- Л+: экспрессия, сидит БАК.

Г+ Л-: нет экспрессии, сидит репрессии

Г- Л-: всё сидит, нет экспресии.

 

Вопрос №77.

Вопрос №78.

Вопрос №79

Особенности регуляции на транскрипционном уровне у эукариот. РНК-полимеразы и особенности инициации транскрипции у эукариот. Особенности организации регуляторной части генов, структура промотора РНК-полимеразы II.

РНК-полимеразы эукариот содержат субъединицы-гомологи бактериальных и ряд субъединиц, отсутствующих у бактерий. У эукариот структура хроматина репрессирует экспрессию генов, поэтому

базовое состояние гена – «выключено». Для активации транскрипции необходимо изменить структуру хроматина. Эти изменения зависят от модификации гистоновых белков и от связывания со специфическими последовательностями ДНК-связывающих регуляторных белков, которые в ряде случаев могут изменять

структуру хроматина прямо (без модификации гистоновых белков).

РНК-поли II: коровый промотор обычно имеет длину ~40-60 нуклеотидов и может простираться как upstream, так и downstream от стартового сайта транскрипции. ТАТА-бокс задает стартовую точку транскрипции. Регуляторные элементы – короткие последовательности нуклеотидов, необходимые для

аккуратной и эффективной транскрипции in vivo. Эти элементы включают проксимальные промоторные последовательности, активаторные последовательности, энхансеры, глушители идр. Все эти элементы связывают регуляторные белки (активаторы и репрессоры), которые помогают или препятствуют транскрипции с корового промотора. Некоторые из этих элементов могут располагаться за десятки и даже сотни т.п.н. от регулируемого ими корового промотора.

РНК-полимераза I – синтез рибосомных РНК (рРНК).

РНК-полимераза II – синтез матричной РНК (мРНК) и большая часть небольших ядерных РНК (мяРНК).

РНК-полимераза III – синтез транспортных РНК(тРНК) и 5S-рибосомной РНК (5SРНК).

Эукариотическая РНК-полимераза не может самостоятельно инициировать транскрипцию. Для ее активации необходимо большое количество белков (факторов транскрипции), которые объединяются в комплекс.

Многие транскрипционные факторы синтезируются или активируются в ответ на определенные сигналы. Сигналами могут служить цАМФ или гормоны.

 

Вопрос №80.

Билет №81

Билет №82

Вопрос №83.                                                                                                            

Вопрос №84 и 87.                                                                                                  

Вопрос №85

Вопрос №86

РНК-сайленсинг. Образование и основная функция miРНК. Гены miРНК. Биологическая роль miРНК.

Ген lin-4 осуществляет негативную регуляцию трансляции гена lin-14, который инициирует переход в личиночную стадию L2. Ген lin-4 кодирует малую РНК, которая частично комплементарна 7-ми

неодинаковым консервативным сайтам на 3’-нетранслируемом участке мРНК lin-14 и связывается с ними.

Транскрипция этих генов осуществляется РНК-полимеразой II. В результате синтезируются первичные miРНК (pri-miРНК), которые образуют специфические шпилечные структуры. Pri-miРНК процессируются белковым комплексом, содержащим фермент DROSHA (РНКаза III), c образованием pre-miРНК (~70 н.). .Pre-miРНК транспортируется из ядра в цитоплазму при участии Экпортина 5. В цитоплазме pre-miРНК

процессируется ферментом Дайсер. В результате образуется дцРНК примерно в 22 н. Короткие дцРНК связываются с ферментативным комплексом RISC. Цепи дцРНК разделяются за счет хеликазной активности. Активная цепь остается в составе зрелого комплекса RISC, вторая удаляется. miРНК-RISC связывается с комплементарными последовательностями в 3’-нетранслируемом участке мРНК-мишени и

репрессирует её трансляцию. Комплементарность неполная.

Микро РНК кодируются генами. Размер генов варьирует от сотен до тысяч п.н. Гены, как правило, расположены в межгенном пространстве белок-кодирующих генов (транскрибируются независимо), но могут находится в интронах или экзонах (транскрибируются в составе других генов. Несколько генов микроРНК могут транскрибироваться в единую полигенную мРНК.

Автономная транскрипция – 1 шпилька и полигенный транскрипт, который после процессинга даст несколько  miРНК. Гены miРНК расположен в интроне или в экзоне другого гена (белок-кодирующего гена и котранскрибируется с ним).

Зрелая miРНК может быть локализована как на 5’-, так и на 3’-плече шпилечной структуры. В ряде случаев оба плеча могут генерировать функциональную miРНК

Все клеточные процессы: эмбриональное развитие, дифференцировка, старение, клеточный цикл, метаболизм, апоптоз, канцерогенез, ….. У человека идентифицировано ~ 1900 генов miРНК и > 35000 мишеней. Биологическая функция – тонкая регуляция экспрессии генов, в

основном, на постранскрипционном уровне. Для miРНК характерны индивидуальные паттерны экспрессии, органо-, ткане-специфичность, зависимость от стадии развития организма.Изменения экспрессии miРНК ассоциированы со многими болезнями. Гены miРНК сами могут действовать, как опухолевые супрессоры или онкогены. Поэтому они являются биомаркерами и могут использоваться в терапевтических целях. Изменения в miРНК выявлены во всех типах рака. Поэтому профилирование miРНК служит диагностическим и прогностическим инструментом.

 

Вопрос №88.                                                                                                            

Генетическая инженерия. Суть технологии. Теоретические основы генетической инженерии. Задачи генной инженерии. Почему необходимо изучать генетическую инженерию. Схема типичного эксперимента по молекулярному клонированию ДНК.

 

Генетическая инженерия – использование основ и методов молекулярной генетики и молекулярной биологии для конструирования организмов с заданными наследственными свойствами. Суть технологии – создание рекомбинантных ДНК и введение их в реципиентные клетки.

Теор основы: ДНК и РНК – носители генетической информации. Установлены общие принципы воспроизведения макромолекул в живых организмах: репликация, транскрипция, трансляция. Универсальность генетического кода. Открытие процесса рекомбинации ДНК. Открытие плазмид и рестриктаз.

Задачи генной инженерии: Создание генетических конструкций для изучения фундаментальных проблем. Получение биопродуцентов. Создание трансгенных организмов с новым сочетанием признаков. Генетическая коррекция. Генотерапия. Сохранение и рациональное использование генофондов.

Схема типичного эксперимента по молекулярному клонированию: Получение фрагмента или фрагментов ДНК, конструирование in vitro рекомбинантных молекул, введение их в клетку, отбор клонов, несущих рекомбинантную молекулу.

 

Вопрос №89

Системы рестрикции и модификации ДНК. Характеристика рестриктаз II типа. Приведите структуру любого шестичленного палиндрома и липких концов фрагментов, при условии, что рестриктаза режет эту последовательность между 1-м и 2-м нуклеотидами. Общие принципы конструирования рекомбинантных молекул с использованием рестриктаз.

Получение фрагментов ДНК - эндонуклеазы рестрикции узнают в ДНК специфические для каждого фермента последовательности нуклеотидов и разрезают ее. Роль систем рестрикции-модификации заключается в защите клеток от проникновения чужеродной ДНК Рестриктазы типа II узнают и раcщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.

Тип II: Состоят из двух белков – R (рестрикция) и M (метилирование), которые функционируют независимо.

Разрезание нуждается только в Mg+2. Сайты узнавания могут быть симметричными или несимметричными.

Расщепляют ДНК в сайте узнавания или на определенном расстоянии от него.

Сайт узнавания BamHI: G’GATCC/CCTAG’G

Sau3A: ‘GATC/CTAG’

PstI: CTGCA’G/G’ACGTC

HpaI: GTT’ACC/CCA’TTG

Образуются выступающие липкие концы.

Фосфатный: у BamHI

Гидроксильный: у PstI

Тупой: у HpaI

ДНК-лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними 3’-OH и 5’-фосфатными концами ДНК.

Есть молекула с А и В с сайтами узнавания BamHI. Обрабатывают рестриктазой, получили липкие концы. Смешали, лигазой сшили.

 

Вопрос №90

Понятие о векторах. Основные и дополнительные свойства векторов. Клонирование в генетической инженерии. Отбор рекомбинантных молекул на примере клонирования в плазмидном векторе с инсерционной инактивацией.

Клонирование – это использование процедур манипулирования ДНК для получения множественных копий гена или фрагмента ДНК. Клонирование достигается с помощью перемещения фрагмента ДНК в векторную молекулу.

Вектор (векторная молекула) – молекула ДНК, способная переносить чужеродную ДНК и обеспечивать ее поддержание в реципиентных клетках: плазмиды и вирусы (фаги).

Вектор должен: автономно реплицироваться в клетках какого-либо хозяина, иметь селективный маркер (маркеры), иметь уникальный сайт (сайты) клонирования, не утрачивать способности к автономной репликации в рез-те инсерции чужеродной ДНК.

Вектор должен: стабильно поддерживаться в клетках, быть мультикопийным, быть небольшого размера, иметь сайты рестрикции внутри генов устойчивости к антибиотикам (для плазмидных векторов).

По происхождению: плазмидые, фаговые: на основе фага λ, на основе однонитевых фагов.

Есть векторы для клонирования и векторы клонирования для ПЦР. pGEMT-easy: несёт бета-галактозидазу. Если вставка произошла, мы разрываем её ген. Галактозидаза  помимо лактозы расщепляет X-Gal. этот Х гал содержит краситель, который при расщеплении х гала высвобождается и окрашивает колонию. вот мы внесли вектор в клетку. Если вектор вставился, то бетагалактозидаза осталась разорваной=> она ничего не расщепляет, колония не окрашена. Если же вектор не вставился, то он замклутся в кольцо=>бетагалактозидаза восстановится и будет расцеплять Х гал=> колония окрасится в синий. Если вставки не произошло, то клетки синие,

Есть плазмида с генами устойчивости к ампицилину и стрептомицину. В гене стрептомицина есть сайт рестрикции. Берём чужеродную ДНК с 2 сайтами рестрикции. Рестриктазим, потом сшиваем. Получаем рек и нерек ДНК. Трансформируем клетку. Клонируем. Рекомб клоны не стойчивы к стрептомицину.

Вопрос №91.                                                                                                            

Вопрос №92.                                                                                                            

Основы генетической инженерии растений. Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens: структурно-функциональная организация и использование для трансформации клеток растений. Технология получения трансгенных растений.

Agrobacterium tumefaciens вызывает образование опухолей. Вирулентные штаммы содержат Ti-плазмиды. Агробактерия проникает в ткань растений через раневую поверхность и определенный участок Ti-плазмиды (Т-ДНК) встраивается в ДНК растений. Ti-плазмиды 150-500 т.п.н. Т-ДНК имеет размер от 3,5 до 25 т.п.н.: онкогены и ген октопинсинтазы. Ещё есть tra, гены катаболизма октопина, tra, rep, vir. Прямые повторы 25 пн. Онкогены кодируют растительные гормоны (ауксины и цитокинины), которые вызывают опухолевый рост клеток. Опины (октопин) – производные аминокислот, кетокислот или сахаров – биологически активные соединения, которые обнаруживаются только в опухолевых клетках растений. Являются ростовыми факторами для вирулентных штаммов агробактерий. Гены катаболизма октопина позволяют

агробактерии использовать октопины, синтезируемые трансформированными растительными клетками, в качестве источника азота, углерода и энергии. vir-гены – контролируют вырезание и передачу Т-ДНК.

Онкогены не участвуют в переносе и интеграции Т-ДНК, поэтому их можно заменить чужеродной ДНК. Рекомбинантные плазмиды утрачивают онкогенные свойства. Поэтому в качестве маркеров используют

прокариотические гены устойчивости к антибиотикам.

Плазмида с геном энтомотоксина + Ti-плазмида = Ti-плазмида с геном энтомотоксина

Трансформация раст клеток, получение каллусов, регенерация транс растений.

Золотой рис с железом и провитамином А.

Снижение экспрессии полугалактуроназы.

 

Билет №93.                                                                                                              

Вопрос №1

Методы.

1.Гибридологический – заключается в гибридизации и последующем учете расщеплений, был предложен Менделем. Правила:

· скрещиваемые организмы должны принадлежать к одному виду.

· Скр.орг. должны четко различаться по отдельным признакам.

· изучаемые признаки должны быть константны, те воспроизводиться из поколения в поколение при скрещивании в пределах линии.

· Необходимы характеристика и количественный учет всех классов расщепления, если оно наблюдается у гибридов первого и последующего поколений.

2.Математический

Мендель применил количественный подход к изучению рез-ов скрещиваний. Сравнение количественных данных эксперимента с теоретически ожидаемыми. Изучение изменчивости наследственной или модификационной.

3.Цитологический

Нужен для изучения клетки как основной единицы живой материи. Исследование строения хромосом, их функций.

4.Физико-химический

Применим для более детального изучения характеристики наследуемых признаков обмена в-в, изучения св-в молекул белков и нуклеиновых кислот + методы иммунологии и иммунохимии. Оптические, седиментационные, методы меченых атомов.

5. Морфометрический

6. Популяционный

7. Генеалогический

Даёт возможность выявить генетические изменения.

Методы:

1. Молекулярный уровень – стр. нуклеиновых к-т. Секвенирование.

2. Субклеточный – цитогенетические методы (микроскопия и окрашивание)

3. Клеточный – онтогенетические методы

4. Организм – мутационный и рекомбинационный анализ, гибридологический, генеалогический, близнецовый методы.

5. Популяция – популяционный анализ, статистические методы.

Вопрос №2

Цитологический метод используется для непосредственного изучения клеточных структур – носителей наследственной информации. Генетическая информация содержится в хромосомах и самовоспроизводящихся клеточных органеллах.

n – число хромосом, с – число молекул ДНК.

Митоз: Клеточный цикл – 4 периода: пресинтетический (G1), период синтеза (S), постсинтетический (G2), и митоз (М). Митоз составляет ок. 1/8 всего клеточного цикла.

Профаза (2 n 4 c ): Спирализация хромосом, каждая сост. из 2 хроматид (результат репликации в S периоде). Исчезают ядрышки и ядерная мембрана.

Прометафаза (2 n 4 c ): Хромосомы двигаются к экватору клетки.

Метафаза (2 n 4 c ): Хромосомы образуют метафазную пластинку, появляются нити ахроматинового веретена. Центриоли находятся на полюсах клетки. Число и форма хромосом, наблюдаемых в метафазе, характеризуют кариотип вида.

Анафаза (4 n 4 c ): Деление цетромер, удерживавших хроматиды в хромосоме. Дочерние хромосомы расходится к противоположным полюсам.

Телофаза и цитокинез (2 n 4 c ): Формируется ядерная мембрана и ядрышки, хромосомы деспирализуются, клетки животных разделяются перетяжкой, у растений образуется фрагмопласт.

Схема: 2n2c – 2n4c – 4n4c - 2n2c.

Мейоз: 2 деления

Профаза 1 (2 n 4 c ):

Лептотена Появление тонких перекрученных нитей хромосом (хромосомы удвоены)

Зиготена Конъюгация хромосом. Появляется синаптонемный комплекс. Досинтез ДНК (0.3%)

Пахитена Гаплоидное число бивалентов. Завершение формирования СК. Досинтез ДНК (0.1%)

Диплотена Начало отталкивания гомологов – различимы хиазмы. Много ядрышек.

Диакинез Спирализация усиливается, число хиазм уменьшается, биваленты на периферии ядра.

Метафаза 1 (2 n 4 c ): Разрушение ядерной мембраны. Ядрышки исчезают. Биваленты выстраиваются в метафазную пластинку.

Анафаза 1 (2 n 4 c ): К разным полюсам расходятся гомологичные хромосомы, состоящие из 2 хроматид. Редукция центоромер.

Телофаза 1(1 n 2 c ): может отсутствовать, или ядро может восстанавливаться

Интерфаза Короткая, нет удвоения хромосом.

Профаза 2, Метафаза 2 (1n2c): по митотическому типу.

Анафаза 2 (2 n 2 c ): Расхождение хроматид.

Телофаза 2 ( nc ): 4 гаплоидных ядра.

Схема: 2n4c – 2n4c – 1n2c – 1n1c.

 

Вопрос №3

Гибридологический метод. Закономерности.

Объект – Pisum sativum (7 пар контраст.признаков – формы семени и зрелых бобов; окраски семядолей, цветов и зрелых бобов; расположение цветков и высота растения).

Метод гибридологического анализа, заключающийся в гибридизации и последующем учете расщеплений, в законченной форме был предложен Г. Менделем.

1. Скрещиваемые организмы должны принадлежать к одному виду.

2. Скрещиваемые организмы должны четко различаться по отдельным признакам.

3. Изучаемые признаки должны быть константны, т. е. воспроизводиться из поколения в поколение при скрещивании в пределах линии (родительской формы).

4. Необходимы характеристика и количественный учет всех классов расщепления, если оно наблюдается у гибридов первого и последующих поколений.

5. Анализируем систему скрещиваний в ряду поколений.

Выявленные закономерности наследования – законы Менделя.

Выявленные законы наследственности:

1) Дискретность генов (гены существуют, есть материальные носители ген. информации, дискретны, единое целое в функ. плане, передаются от родителей к потомкам, не берутся ниоткуда)

2) Относительное постоянство генов

3) Парность генов

4) Правило частоты гамет

 

Вопрос №4

Закон чистоты гамет

Аллели не исчезают никуда, не берутся ниоткуда, передаются в неизменном виде. В каждую гамету попадает только один аллель из пары аллелей данного гена родительской особи. Если у особи присутствует и доминантная, и рецессивная аллель, то доминантная маскирует рецессивную. Связь между поколениями при половом размножении осуществляется через половые клетки — гаметы. Следовательно, необходимо допустить, что каждая гамета несет только один фактор из пары. Появление во втором поколении рецессивного признака одного из родителей может быть только при двух условиях:

1) если у гибридов наследственные факторы сохраняются в неизменном виде;

2) если половые клетки содержат только один наследственный фактор из аллельной пары.

Расщепление потомства при скрещивании гетерозиготных особей Мендель объяснил тем, что гаметы генетически чисты, то есть несут только один ген из аллельной пары. Мендель не связывал наследств. факторы с конкретн. матер. структурами, цитологическое обоснование появилось позже: Во время мейоза у гибрида F1(Аа) разные пары хромосом расходятся в дочерн.клетки независимо =>при случ. оплодотворении – 3 типа зигот (АА, Аа и аа).

Другое док-во – тетрадный анализ: проводится на орг-х, у которых все 4 продукта мейоза остаются вместе и могут далее функц. как вегетет. клетки (аскомицеты). У аскомицетов в рез-те мейоза дипл. вегет. клетки образ. аски, содерж. по 4 гапл. аскоспоры. Аскоспоры можно извлечь и получить вегет. клон - культуру каждой из них. Если исходный диплоид был гетерозиготен по к-л. гену,напр. ADE2/ade2, то в каждой тетраде две споры обычно образ. белые колонии(ADE2), а две другие - красные (ade2).Это расщепление - общая закономерность, характерная для моногенного наследования. Т.о., тетрадный анализ доказывает, что в основе менделевских соотношений лежит строгий биол. закон гаметического расщепления 2A:2a в каждом мейозе.

Вопрос №5

Дата: 2019-02-02, просмотров: 568.