Делится на экстенсивную и интенсивную. Экстенсивная очистка – неуправляемый рост м/о (поля орошения, биопруды). М/о концентрируются в верхних слоях почвы или тонкой водной пленке. Образуются биоценозы, которые обеспечивают очистку. Интенсивная очистка – на основе деятельности активного ила или биопленки. Активный ил – тёмно-коричневые хлопья размером до неск. сотен микромертов. Состоит из 70% живых м/о и 30% неорганических частиц. Живые организмы вместе с твердым носителем образуют зооглей - симбиоз популяций микроорганизмов, покрытый общей слизистой оболочкой. МО, выделенные из активного ила относятся к различным родам: Actynomyces, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas (наиболее многочисленны). Они окисляют спирты, жир.кислоты, углеводы. Bacillus утилизируют алифатические углеводороды. Флавобактерии – деградация нефти, парафинов. На формирование биоценозов активного ила влияют сезонные колебания температуры. В зимний период – психрофильная форма м/о; с потеплением – мезофильные. Важную роль в формировании сообществ играют простейшие (жгутиковые, инфузории). Сами они не участвуют в потреблении органических веществ, но регулируют видовой и возрастной состав активного ила. Поедая м/о, они способствуют образованию ферментов. В активном иле высокого качества должно быть 10-25 клеток простейших на 1 млн бактериальных клеток. Простейшие чувствительны к фенолам, альдегидам.

Активный ил: 1) биомасса представляет собой микрофлору, содержащую ферментные системы для ликвидации загрязнений; 2) биомасса обладает сильной адсорбционной способностью; 3) способно образовывать активные глобулы. На всех уровнях одинаковое количество м/о и состав. Используют биофильтры, в них на разных уровнях свои биоценозы, разные по составу.

Основные параметры, влияющие на биологическую очистку: температура, рН, количество растворенного кислорода, уровень перемешивания, концентрация и возраст активного ила, концентрация и состав загрязнения.

44. Хранение микроорганизмов-продуцентов. Лиофилизация.

1. Субкультивирование, или метод перевиваемых культур: периодический Пересев на свежие агаризованные среды, относится к методам поддержания и сохранения бактер-ных культур как в лабор-ных, так и промышленных условиях. Интервал между пересевами зависит от микроорг-ма, используемой среды, темпер-ных условий хранения. Преимущ-ва и недостатки ме-да: Метод прост в исполнении и использ-ся для многих микроорг-мов. Он общедоступен и позволяет легко контролировать чистоту штаммов. Недостатками: необходимость соблюдения регламентов пересевов, потребность в большом колич-ве посуды, питат-ных сред, значит-ные затраты времени, риск загрязнения культуры, ошибки при обозначении штаммов или наклеивании неправильной этикетки, риски потерь культур и т.д При частых пересевах штаммы-продуценты из-за спонтанной диссоциации нередко могут терять или снижать способность к выработке целевых продуктов.

2. Хранение под минеральным маслом: с помощью этого ме-да (простой, дешёвый) удается успешно сохранять месяцами или годами многие виды бактерий. Для этого метода исп-зуют стерильное минерал-ое масло медицинского назначения (напр, вазелиновое масло). Масло стерилизуют в сушильном шкафу при т=170°С , 1–2 ч. Культуры выращивают в пробирках – на скошенном питательном агаре. В пробирки с выросшими микроорг-ми стерильно наливают слой минерал-го масла высотой не менее 2 см. Масло защищает культуры от высыхания и понижает их метаболизм. Покрытые маслом культуры хранят в вертикальном положении в холодильнике. Обычно культуры пересевают 1-2 раза в год на свежую среду. Пересеянные культуры снова покрывают стерильным маслом. Недостатки метода.как и субкультивир-ния. Всегда велика вероятность загрязнения и потери штамма из-за использования нестерильного масла.

3. Хранение в воде и водно-солевых р-рах: Этот ме-д применим для большин-ва микроорг-мов, если их требуется сохранить в течение, например, месяца. Клетки с плотностью не более 10⁹ КОЕ/мл вносят в пробирку с индифферентной жидкостью с физиологическим ионным составом и подходящим рН. Пробирки с инокулятом хранят в холодильнике при температуре 4–8°C. Недостатки метода. Велика вероятность загрязнения штаммов вследствие благоприятных условий (влажность и температура) для роста грибной флоры во внутрен. объеме пробирки.

4.Хранение высушиванием на твердых носителях: Большин-во бактер-ных культур гибнет при высыхании в лабор-ных условиях. Но нек-рые культуры, если были высушены в подходящих для них носителях, сорбирующих влагу, сохраняются годами. В практике хранения микроорг-мов использ-ся носители – почва, песок, бумага, смолы, желатин, активный уголь, зерна злаков и многие др. Почва. Спорообразующие бактерии можно успешно хранить годами в стерильной почве, высушенной на воздухе. Почву стерилизуют автоклавиро ванием по нескольку часов в течение двух дней. Инокулят из суспензии спор (по 1 мл) вносят в пробирку со стерильной почвой и оставляют при комнатной температуре до заметного высыхания. Затем пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками и хранят в холодильнике. Аналогично поступают и при использовании в качестве носителей песка, семян злаковых (например, проса). Культуры актиномицетов, находящихся в стерильной почве, сохраняют жизнеспособность в течение 30 и более лет. Бумага. Недорого и просто. Хранятся и высушив-ся бактерии на полосках или дисках стерильной фильтровальной бумаги. В общей пробирке или в пузырьке с закручивающейся крышкой можно хранить много дисков, содержащих одну и ту же культуру. При необходимости диск достают стерильным пинцетом и в стерильных условиях вносят его в соответ-щую пит-ную среду. Суспензию бактерий, содержащей не менее 108 клеток/мл, и высушивают на воздухе или под вакуумом. Полоски или диски бумаги хранят в запечатанных пробирках в эксикаторах, которые лучше всего поместить в холодильник. Желатина. Многие гетеротрофные бактерии можно хранить в высушенных каплях или дисках желатины. Культуры выращивают в подходящих для них средах. 

5.Хранение замораживанием при температурах ниже точки кристаллизации воды. (Обычное замораживание) От хранения в воде и водно-солевых р-рах данный метод отличается тем, что емкости с образцами помещают в морозильную камеру холодильника при температуре от минус 10 до минус 20°С. Это позволяет продлить сохранность штаммов и уменьшить вероятность их загрязнений. Некоторые бактерии при таком способе консервации оставались живыми от 6 месяцев до 2 лет хранения. Недостатки метода: Этот способ не рекомендуется приме- нять для криочувствительных бактерий.

6.Консервация замораживания при низких температурах: Практически все известные группы бактерий способны длительно храниться в замороженном состоянии при низких (криогенных) температурах (температуры менее минус 153 °С). Такую температурную область хранения обеспечивают сжиженные газы – воздух, азот, неон водород, гелий. В основном исп-ся азот. Недостаток метода: Азот дорогой.

Консервирование высушиванием из замороженного состояния: способ высушивания биоматериалов из замороженного состояния, при котором вода испаряется в условиях вакуума без оттаивания льда, что позволяет полностью сохранять первичную стр-ру объекта сушки. При его использовании многие виды бактерий удается сохранять в жизнеспособном состоянии 30 лет и более. Для этого высушенные клетки должны быть защищены от действия кислорода, влаги и света. Лиофилизация - это процесс удаления воды из замороженного материала. Лед переходит в пар, минуя жидкую фазу. Процесс осуществ-ся в вакууме, в условиях заморозки продукта от минус 10 до минус 70°С. Ме-тод позволяет получать сухие ткани, препараты, продукты без потери их структурной целостности и биологич-ой активности. При Л. большин-во белков не подвергается денатурации и может длительно сохран-ся при 0°С. Лиофилизированные ткани и препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства. Л. применяют при необходимости продолжительного хранения и консервирования различ.продуктов биологич-го происхождения, для получения сухой плазмы донорской крови, сухих сывороток и вакцин, при трансплантации органов и тканей, в фармацевтической и пищ. промышлен-ти. Преимущества: Метод позволяет получать сухие ткани, препараты, продукты без потери их структурн. целостности и биологич. активности. При лиофилизации большинство белков не подвергается денатурации и может длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0 °C). Лиофилизированные ткани и препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства. Недостатки: Необходимость тщательной подготовки препарата к сушке, создание высокого вакуума для полноты высыхания, длительность сушки и достаточно высокие энергозатраты.

45. Разделение жидкости и биомассы: флотация, фильтрование и центрифугирование.

    Первым этапом в процессе очистки целевого продукта является разделение культуральной жидкости и клеточной биомассы — сепарация. В некоторых случаях сепарации предшествует специальная обработка реакционной смеси, способствующая более  эффективному отделению биомассы и стабилизации выделяемого продукта. Применяются различные методы сепарации.

Флотация. Метод используется в том случае, если клетки  продуцента в силу низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях содержимого биореактора. Особые устройства (флотаторы) различной конструкции удаляют образующуюся при культивировании пену вместе с прилипшими к пузырькам газа клетками. Повышение эффективности отбора биомассы достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя механическим путем. Достоинствами метода являются его экономичность, высокая производительность и возможность использования в непрерывных процессах.

Фильтрация. Различны применяемые в настоящее время фильтрующие системы (барабанные, ленточные, тарельчатые фильтры, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы, мембранные фильтры) основаны на одинаковом принципе - задержке биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Недостатком способа является налипание клеток на фильтре, слой которых снижает скорость протока жидкости в процессе фильтрования. Для фильтров непрерывного действия предусматриваются системы автоматической очистки от биомассы, забивающей поры. Она может сдуваться с поверхности фильтров сжатым воздухом или удаляться специальными "ножами". Существуют также фильтры  для многократного или однократного периодического использования. Например, мембранные (в частности, тефлоновые) фильтры, позволяющие фильтровать очень разбавленные клеточные взвеси. Однако проблемой их использования является быстрая закупорка пор клетками, белками и другими коллоидными частицами. 

3. Центрифугирование. Данный способ требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование, поэтому он применяется, если: а) суспензия фильтруется слишком медленно; б) возникает необходимость максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся в ней частиц; в) требуется

обеспечить непрерывный процесс сепарации, когда фильтры рассчитаны на периодическое действие.

46. Выделение  и очистка продуктов.

Осаждение растворенных веществ осуществляется физическими (нагревание, разведение или концентрирование, охлаждение раствора) или химическими воздействиями, переводящими растворенное вещество в малорастворимое состояние. 

Экстракция  подразделяется на твердо-жидкофазную (при которой продукт из твердой фазы переходит в жидкую) жидкофазную (когда обеспечивается перевод продукта из одной жидкой фазы в другую, также жидкую фазу). Твердо-жидкофазная экстракция сводится порой к простой обработке твердого образца водой или органическим растворителем с целью извлечения из него растворимых соединений. Достаточно широко применяются различные органические растворители, в частности экстрагирование ацетоном, который эффективно переводит в раствор ряд липидных и белковых компонентов клеток.

При жидко-жидкофазной экстракции используются различные  органические растворители - алкилфенолы, эфиры, галогениды, гексан, хлороформ и др. Почти полностью избежать инактивации позволяют методы экстрагирования на холоде, т. е. путем использовании методов криоэкстракции. При этом уравниваются различия между твердым субстратом и культуральной жидкостью, поскольку и то и другое находится в замороженном состоянии (в одной фазе). Криоэкстракция проводится с применением растворителей, температура кипения которых низка и при обычной комнатной температуре находится в газообразном состоянии.

Адсорбция  является достаточно распространенным методом отделения продукта и рассматривается в качестве частного случая экстракции, при котором экстрагирующим агентом служит твердое тело. Механизм ее сводится к связыванию выделяемого из жидкой или газообразной фазы вещества поверхностью твердого тела. Традиционными адсорбентами являются древесный уголь, пористые глины и т. п.

Электрохимические методы широко внедряются в технику очистки сточных вод, в частности для опреснения сильно минерализированных вод электролизом с регенерацией индивидуальных солей, кислот и щелочей.

Ионообменная хроматография является более частным вариантом ионной хроматографии. Этот вариант хроматографии позволяет разделять ионы и полярные молекулы, на основании зарядов разделяемыхмолекул.

Данный вид хроматографии позволяет разделить практически любые заряженные молекулы, в том числе: крупные — белки, малые—молекулы нуклеотидов и аминокислот. Часто ионообменную хроматографию используют как первый этап очистки белков.

47.Концентрирование, модификация, стабилизация  продукта.

Концентрирование продукта проводят методами обратного осмоса, ультрафильтрации, выпаривания.

Если мембрана пропускает воду, задерживая растворенные в ней вещест­ва, речь идет об осмосе.

Ультрафильтрация - отделение веществ с помощью мембранных фильтров.

Наиболее древний метод - выпаривание. Его недостаток состоит в не­обходимости нагревания, которое проводят при низком давлении. Используют вакуум-выпарные аппараты. Нагревающим агентом чаще всего служит водяной пар, хотя используют также обогрев жидким теплоносителем или электрообогрев. Пар характеризуется большой теплотой конденсации и облегчает регулиров­ку процесса выпаривания.

Обезвоживание продукта - сушка на подносах, на ленточном конвейере с подогревом, подачей газообразного нагревательного агента (воздух, СО₂, ды­мовые или топочные газы и др.) в сушильный аппарат, в вакуум - сушильных шкафах, в барабанных и распылительных сушилках.

Модификация продукта - перестройка полученных соединений живот­ного, растительного или микробного происхождения с целью придания им спе­цифических свойств, необходимых человеку. Химическая модификация необхо­дима в тех случаях, когда биотехнологический процесс дает лишь «заготовку» целевого продукта.

Модификация - необходимый этап в получении ряда ферментов, гормо­нов, препаратов медицинского назначения. Например, у бычьего инсулина «от­стригают» аминокислотные остатки, после чего он становится идентичным чело­веческому гормону.

Стабилизация продукта направлена на сохранение свойств продукта в период его хранения и использования потребителем (добавление наполнителей, модификация и др.). Включает физико-химические воздействия на продукт. Сушка повышает устойчивость продукта к внешним воздействиям. Обезвожива­ние ферментов вызывает их устойчивость к нагреванию.

К стабилизации продуктов, в том числе кормового микробного белка, ве­дет добавление наполнителей из грибного мицелия, пшеничных отрубей, куку­рузной муки, которые сами обладают питательной ценностью.