Иммунный ответ - сложный процесс межклеточных взаимодействий различных типов лимфоидных клеток с участием специальных гормонов, в результате чего В-лимфоциты начинают активно синтезировать и выделять в кровь специфические антитела против данного антигена. На поверхности В-лимфоцитов существуют рецепторы, аналогичные антителам, взаимодействие которых с антигеном в сложном межклеточном комплексе служит стимулом для начала биосинтеза антител.

       Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Антитела выделяют из сыворотки в виде γ-глобулиновой фракции, осаждая сыворотку крови сульфатом аммония, спиртом. Полученные антитела содержат много примесных белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной хроматографии. Стандартные препараты получить довольно сложно, так как состав их зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации, других малоконтролируемых факторов. В то же время, для современного биохимического анализа очень важна специфичность, то есть способность выделить данное вещество в сложных многокомпонентных средах, таких, как сыворотки крови, сок растений, ферментная среда. Такое возможно при использовании иммунохимического метода, использующего антитела, взаимодействующие узко специфично по принципу "антиген - антитело". Для проведения такого анализа необходимы абсолютно идентичные антитела, синтез которых обычными способами не приемлем. Если слить иммунную клетку с опухолевой, образуются гибридные клетки, способныенеограниченно долго жить в искусственных средах. Одновременно они сохраняют способность синтезировать антитела.

Гибридомы, синтезирующие определенные виды антител, отбирают на селективных ростовых средах. Затем их помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных клеток (клон). Такие клоны могут синтезировать антитела, получившие название моноклональных (МКА). МКА - антитела, однородные по структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах.

Другой метод получения антител основан на инъекции полученной гибридомы в брюшную полость мышки. Там гибридома реплицируется и вызывает образование асцитной опухоли (скопления клеток, плавающих в жидкости, заполняющей брюшную полость). Асцитная жидкость, выделенная из этой мыши, представляет суспензию, содержащую антитела. Клетки и белки, не относящиеся к МКА, удаляются. Оставшийся материал, представленный преимущественно антителами, используют. Этот метод позволяет получать высококонцентрированные препараты антител. Получаемый материал требует доочистки. Это дорого и трудоемко, поэтому в настоящее время предпочтение отдается первому способу, с использованием культуры клеток.

28. Применение моноклональных антител (МКА)

Иммунологический анализ (биол. исследования, медицина). Лабораторная диагностика заболеваний, Мон Ат - диагностическая тест-система. М Ат исп-ся в коммерческих наборах для проведения радиоиммунологического анализа, кот-й позволяет определить очень небольшие кол-ва в-в путем вытеснения меченного радиоактивным изотопом Аг из комплекса со специфическим Ат при добавлении все возрастающего кол-ва немеченного испытуемого или стандартного Аг. Применяются для опред-я БАВ – белков крови, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и др. Альтернативный метод анализа, когда исп-ся избыток меченных Ат – иммунорадиометрический. Иммуногистохимия (биол. исследования, медицина). Меченные Ат исп-ся для изучения распределения Аг в срезах тканей с помощью светового и электр-ого микроскопа. При работе по общепринятому «сендвич-методу» на срез наносят немеченные специфические Ат, отмывают их избыток, а затем добав-т Ат против Ig (обычно несущее флуорисц-ую метку или связанное с ферментом) =>осущ-ся непрямое мечение изучаемого Аг. Пример использования М Ат для гистопатологич-й диагностики заболеваний чел-ка: 1) анализ образцов ткани лимфатических узлов – способ опред-я типа опухолей лимфатич. системы; 2) диагностика для опред-я природы кл-к, давших начало опухоли, по типу содержащегося в них Аг.Типирование подлежащих пересадке тканей. Гуморальные и клеточные р-ции, ответственные за отторжение тканей и орг-в при межвидовой их пересадке или при пересадке не родственному пациенту, направлены против Аг гистосовместимости, располож-х на поверх-ти кл-ок. Это белки – HLA, ответственные за узнавание организ-м «своих» и «чужих» кл-к. Предварительный подбор HLA-гаплотипов донора и реципиента улучшает рез-ты операции при пересадке орг-в. Типирование HLA-комплекса у пациентов улучшается, если применить М Ат против разл-х Аг комплекса HLA, участвующих в патологических процессах, др-е иммунные механизмы при этом не страдают. Диагностика злокачественных новообразований и наблюдение за ними. М Ат примен-ся для исслед-я локализации злокачественного новообразования и степени метастазирования исп-т метод введения в орг-м специфичных к опред-й опухол.клеточ. популяции М Ат, связанных с радиоактивными изотопами. исп-ся для оценки первичных р-ций опухолей в ходе лечения invivo и при анализе препаратов при биопсии. Направленное введение лекарственных препаратов. М Ат применяют для введения лекар-х в-в и токсинов в опред-ую часть тела (пример: опухоль) путем присоед-я к таким в-вам, путем связывания с поверх-ю липосом, содержащих такие в-ва. Что позволяет направленно обнаруживать и уничтожать опухоль не повреждая здоровые ткани. Передозировка лекарств. Ат против лекар-х препаратов, полезны для снятия последствий его предозировки. Получение важных для медицины в-в. Пример: исп-я М Ат для очистки и крупного производства важных для мед-ны в-в – ковалентное пришитие мышиного М Ат против лейкоцитарного интерферона чел-ка к твердому носителю – сефарозе. => получен специфич.иммуноадсорбент, кот-й позволил за один цикл очистить в 5000 раз лимфобластоидный интерферон. Обнаружение загрязнителей окруж-ей среды;Проверка пищевых продуктов на наличие опасных МО; Диагностика инфекц-ных заболеваний чел-ка, животных, раст-й, Исп-ся в биотех-гии в кач-ве лигандов для аффинной хроматографии. Благодаря высокий специфичности МАт исп-ся в качестве зондов для точного определения природы мол поверх-ти кл-к и клеточных органелл. С их помощью также можно проводить детекцию активности ферментов.

29. Иммобилизованные клетки и ферменты, преимущества их использования в биотехнологии
Иммобилизация – физическое разделение биообъекта (клетка, фермент) и растворителя, то есть биообъект закреплен на нерастворимом носителе, а субстрат и продукты свободно обмениваются между биообъектом и растворителем. Иммобилизация ферментов – это перевод их в нерастворимое состояние с сохранением (частичным или полным) каталитической активности. Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ:

1.Такие ферменты представляют собой гетерогенные катализаторы, легко отделяющиеся от реакционной среды;

2. Могут использоваться многократно;

3.Обеспечивают непрерывность каталитического процесса.
Кроме того, иммобилизация ведёт к изменению свойств фермента:

- Субстратной специфичности;

- Устойчивости;

- Зависимости активности от параметров среды.

Иммобилизованные ферменты долговечны и в десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65°С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60%-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным ферментом.

Это обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.

Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ:

1.отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;

2.снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;

3.более высокая активность и стабильность;

4.возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов;

5.способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов.

Свойства иммобилизованных ферментов (преимущества и недостатки их использования). Отличие от нативных ферментов: изменяется конфигурация, пространственная структура. Даже для получения чистых веществ можно использовать не очень очищенный фермент, если он включен в матрицу геля (полимера) или в капсулы. Требование к чистоте иммобилизованного фермента снижены. Неочищенные ферменты при иммобилизации остаются более стабильными. Когда фермент является внутриклеточным (не входит в среду), могут быть использованы сами клетки, синтезирующие этот фермент, могут быть использованы части клеток (оболочки после их дезинтеграции). Чаще используются целые клетки, нежизнеспособные, но с ферментативной активностью. Такие клетки называются мумии. Мумии, помещенные на носитель или в носитель, медленно разлагаются, но ферменту это не мешает. При выделении фермент отрывается из естественной среды и становится уязвимым.

Многие процессы биотрансформации осуществляются живыми клетками, способными к размножению, так как фермент действует с участием кофермента, который часто требует для своей активности существование именно живой клетки.